冀 宏，趙黎明

(1.天津大學(xué)管理與經(jīng)濟(jì)學(xué)部，天津 300072；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

摘 要：以深層發(fā)酵菌絲體生物量為考察指標(biāo)，對(duì)白靈菇液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)正交試驗(yàn)(L9(34))確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方。在此基礎(chǔ)上，基于三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)曲面分析法對(duì)影響白靈菇菌絲體生長(zhǎng)的發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳培養(yǎng)基組分為

(g/100mL)：可溶性淀粉3.50、牛肉膏0.40、磷酸二氫鉀0.25、硫酸鎂0.25；當(dāng)搖瓶發(fā)酵溫度為26℃、轉(zhuǎn)速為160r/min，發(fā)酵周期7.5d(180h)時(shí)，發(fā)酵菌絲體生物量可達(dá)1.6004g/100mL 。

關(guān)鍵詞：白靈菇；深層發(fā)酵；生物量；正交試驗(yàn)；響應(yīng)面法

基于生物量的白靈菇菌株篩選及其深層發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

冀 宏1,2，趙黎明1

(1.天津大學(xué)管理與經(jīng)濟(jì)學(xué)部，天津 300072；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500)

摘 要：以深層發(fā)酵菌絲體生物量為考察指標(biāo)，對(duì)白靈菇液體深層發(fā)酵的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)正交試驗(yàn)(L9(34))確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方。在此基礎(chǔ)上，基于三因素三水平的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)曲面分析法對(duì)影響白靈菇菌絲體生長(zhǎng)的發(fā)酵溫度、搖瓶轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳培養(yǎng)基組分為

(g/100mL)：可溶性淀粉3.50、牛肉膏0.40、磷酸二氫鉀0.25、硫酸鎂0.25；當(dāng)搖瓶發(fā)酵溫度為26℃、轉(zhuǎn)速為160r/min，發(fā)酵周期7.5d(180h)時(shí)，發(fā)酵菌絲體生物量可達(dá)1.6004g/100mL 。

關(guān)鍵詞：白靈菇；深層發(fā)酵；生物量；正交試驗(yàn)；響應(yīng)面法

白靈菇(Pleurotus nebrodensis)屬真菌門(mén)、擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，又名阿魏蘑、阿魏菇、阿魏側(cè)耳等，是國(guó)內(nèi)主要人工栽培食用菌種類(lèi)之一[1]。目前，白靈菇栽培工藝主要采用固體菌種技術(shù)，受到季節(jié)和原材料的限制，且生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高和易污染。實(shí)踐證明[2]，通過(guò)食用菌深層液體發(fā)酵工藝制備的液體菌種可替代固體菌種用于栽培生產(chǎn)，相對(duì)于固體制種技術(shù)，液體菌種具有生產(chǎn)周期短、菌齡一致、發(fā)育點(diǎn)多、菌絲生長(zhǎng)速度快、成本低等優(yōu)勢(shì)[3]，因此，對(duì)白靈菇深層液體發(fā)酵技術(shù)的研究展現(xiàn)出誘人的應(yīng)用前景。

國(guó)外Choi等[4]對(duì)白靈菇液體培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，當(dāng)溫度為25℃、接種量為5%、初始pH6.5～7.0時(shí)菌絲體生物量可達(dá)1.284g/100mL 。在國(guó)內(nèi)，根據(jù)王廣耀[5]、危茂貴[6]、黃聰亮[7]等的研究，以玉米粉、葡萄糖、黃豆粉、蔗糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4為培養(yǎng)基主要成分，得到的發(fā)酵白靈菇菌絲體生物量最高可達(dá)2.75g/100mL 。在發(fā)酵培養(yǎng)條件方面，根據(jù)任海霞[8]、孟俊龍[9]、蘭蓉[10]、胡順珍[11]等的研究，以接種量、裝液量、初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間為主要的考察條件，得到的白靈菇菌絲體生物量最高可達(dá)2.16g/100mL 。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)從來(lái)自國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)的19個(gè)白靈菇生產(chǎn)菌種中篩選出生長(zhǎng)速度快，品質(zhì)好的菌株(河北武安天山2號(hào))為出發(fā)菌株，以白靈菇發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量為測(cè)定指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在縮短發(fā)酵周期、提高菌絲體生物量，為深層發(fā)酵制備白靈菇液體菌種技術(shù)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 白靈菇菌種

分別自相關(guān)高校、科研院所及合法食用菌生產(chǎn)銷(xiāo)售機(jī)構(gòu)獲得國(guó)內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)的19個(gè)白靈菇菌種(表1)。并采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)序列多態(tài)性分析技術(shù)對(duì)上述菌種進(jìn)行了遺傳學(xué)鑒定(相關(guān)研究?jī)?nèi)容另文報(bào)道)。以上各菌株經(jīng)PDA培養(yǎng)基活化，保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

優(yōu)勢(shì)菌株篩選培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂20，pH值自然。

一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨4、磷酸二氫鉀3、硫酸鎂1.5、VB10.02，pH值自然。

碳源供試培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨4.0、磷酸二氫鉀3.0、硫酸鎂1.5、碳源20(葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉)，pH值自然。

氮源供試培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、磷酸二氫鉀3.0、硫酸鎂1.5、氮源4.0(牛肉膏、胰蛋白胨、酵母膏、硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀)，pH值自然。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQLY-180型振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；CH1200893型分析天平 伯拉莫貝林精密儀器有限公司；CJ-1S型超凈工作臺(tái)、WGL-45B電熱鼓風(fēng)干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司；PQX-280A-22HM人工氣候箱 寧波萊?？萍加邢薰?；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 菌絲體生物量測(cè)定

菌絲體生物量的測(cè)定采用菌絲體干質(zhì)量法，將發(fā)酵醪液過(guò)80目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩，用蒸餾水沖洗3次，將過(guò)濾所得的菌絲體于60℃數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，用分析天平稱(chēng)質(zhì)量，得菌絲體干質(zhì)量[12]。

1.3.2 優(yōu)勢(shì)菌株篩選

在同等條件下，將不同產(chǎn)區(qū)白靈菇菌種分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中，重復(fù)3次。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀(guān)察并記錄菌絲萌發(fā)情況。待菌絲在培養(yǎng)基表面開(kāi)始生長(zhǎng)，用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，每隔24h測(cè)量1次，連續(xù)測(cè)量5次，計(jì)算菌絲體日均生長(zhǎng)速率；同時(shí)觀(guān)察記載菌絲長(zhǎng)勢(shì)：菌絲粗細(xì)、濃密程度及色澤等[13]。選擇菌絲體日均生長(zhǎng)速率最快，長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株作為供試菌株。菌絲體日均生長(zhǎng)速率利用如下公式計(jì)算。

1.3.3 一級(jí)搖瓶菌種的制備

配制一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基，將配好的培養(yǎng)基分裝入250mL的搖瓶中，每瓶分裝100mL，于121℃滅菌20min，冷卻備用。取白靈菇優(yōu)勢(shì)菌株，無(wú)菌操作接種0.5cm×0.5cm的菌種塊(10日菌齡)于搖瓶?jī)?nèi)，注意盡量使菌塊漂浮在液面上。每瓶接種3塊。26℃靜置培養(yǎng)24h，然后置于26℃恒溫振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時(shí)間12d。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源和氮源篩選實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 不同碳源對(duì)產(chǎn)菌絲體的影響

將配制好的1.1.2節(jié)碳源供試培養(yǎng)基分裝入250mL的搖瓶中，每瓶分裝100mL，于121℃滅菌20min，冷卻之后在無(wú)菌條件下將預(yù)先制備的白靈菇一級(jí)搖瓶菌絲體接種到培養(yǎng)基中，接種量為10%，置于26℃，180r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)6d。每組設(shè)置3個(gè)平行。并對(duì)篩選出的最佳碳源進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定最佳水平范圍。

1.3.4.2 不同氮源對(duì)產(chǎn)菌絲體的影響

配制1.1.2節(jié)氮源供試培養(yǎng)基，方法同1.3.4.1節(jié)。并對(duì)篩選出的最佳氮源進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定最佳水平范圍。

1.3.5 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)

基于最佳碳、氮源篩選結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)(L9(34))設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。發(fā)酵條件：26℃、搖瓶轉(zhuǎn)速180r/min、培養(yǎng)液裝量100mL/250mL 三角瓶、接種量為10%、pH值自然、發(fā)酵時(shí)間6d，以菌絲體生物量為考察指標(biāo)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行。因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.3.6 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

選用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，分別考察發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期對(duì)白靈菇產(chǎn)菌絲體的影響，確定各影響因子的最佳范圍。

艾迪僅在屬于她的唯一一篇內(nèi)心獨(dú)白中發(fā)聲，其內(nèi)心獨(dú)白被福克納濃縮至寥寥數(shù)語(yǔ)，卻又如此豐富?！对谖覐浟糁H》更以艾迪·本德倫的視角為核心，在艾迪的視角下，她對(duì)這場(chǎng)葬禮的感知是:對(duì)丈夫安斯的復(fù)仇。她在內(nèi)心獨(dú)白中如是說(shuō):“而我的報(bào)復(fù)將是他永遠(yuǎn)也不知道我在報(bào)仇。達(dá)爾出生后我要求安斯做出許諾，等我死后把我運(yùn)回杰弗遜去安葬?！保?］

1.3.6.1 發(fā)酵溫度的影響

分別設(shè)定發(fā)酵溫度24、25、26、27、28℃5個(gè)水平。分別在接種量10%、搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下發(fā)酵6d，測(cè)定菌絲體生物量，每個(gè)水平試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。

1.3.6.2 搖床轉(zhuǎn)速的影響

在發(fā)酵溫度26℃條件下，設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速為120、140、160、180、200r/min分別考察對(duì)發(fā)酵產(chǎn)菌絲體的影響。其他條件及方法同1.3.6.1節(jié)。

1.3.6.3 發(fā)酵時(shí)間的影響

設(shè)定發(fā)酵24h后每隔24h測(cè)定發(fā)酵菌絲體生物量和發(fā)酵液pH值，共測(cè)定9d，考察不同發(fā)酵周期對(duì)產(chǎn)菌絲體的影響。培養(yǎng)溫度26℃、搖床轉(zhuǎn)速180r/min，其他條件及方法同1.3.6.1節(jié)。

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用響應(yīng)面法(RSM)中Box-Behnken模型對(duì)影響白靈菇深層發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化。數(shù)據(jù)處理軟件為SAS軟件。

參照文獻(xiàn)[14-20]進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面分析法(RSM)設(shè)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵周期為自變量，分別為X1、X2、X3；每一自變量的低、中、高水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼，以菌絲體生物量為因變量，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行，如表3所示。

2 結(jié)果與分析

白靈菇菌絲體發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌株篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。以菌絲體日均生長(zhǎng)速率為指標(biāo)，14號(hào)菌株(河北武安天山2號(hào))的菌絲體日均生長(zhǎng)速率要高于其他18種白靈菇菌株，其菌絲體日均生長(zhǎng)速率達(dá)0.48cm/d。通過(guò)平板培養(yǎng)過(guò)程的觀(guān)察，河北武安天山2號(hào)菌株的生長(zhǎng)速率較快，長(zhǎng)勢(shì)較好且菌絲粗壯，這也有利于工業(yè)生產(chǎn)上縮短發(fā)酵周期，因此選擇河北武安天山2號(hào)作為進(jìn)一步研究的菌株。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源和氮源篩選

2.2.1 碳源篩選結(jié)果

碳源是細(xì)胞 結(jié)構(gòu)的重要組成成分，又是菌體產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)貯藏物質(zhì)的主要原料[21]。因此，選出適宜的碳源對(duì)其深層發(fā)酵至關(guān)重要。

由圖2可知，最佳碳源為可溶性淀粉，生物量為0.577g/100mL 。其次為果糖。乳糖對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最小，生物量?jī)H為0.318g/100mL 。由數(shù)據(jù)可知白靈菇對(duì)多糖的利用明顯好于單糖和二糖。這是因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的糖一般能被菌體快速利用，但過(guò)多會(huì)過(guò)分加速呼吸，使溶氧不能滿(mǎn)足需要，并使一些中間產(chǎn)物不能完全氧化而積累，影響某些酶的活性，從而抑制菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。對(duì)白靈菇這樣的真菌培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，如只將單糖或二糖作為碳源，必然導(dǎo)致菌體中后期生長(zhǎng)受抑制；而多糖則需經(jīng)菌體產(chǎn)生的胞外酶水解成單糖后再被吸收利用，克服了單糖、二糖代謝過(guò)快的缺點(diǎn)[22]。

2.2.2 氮源篩選結(jié)果

由圖3可知，最佳氮源為牛肉膏，生物量達(dá)到0.317g/100mL ；其次為胰蛋白胨；酵母膏對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最小，生物量?jī)H為0.035g/100mL 。白靈菇在無(wú)機(jī)氮中生長(zhǎng)緩慢，這是因?yàn)闊o(wú)機(jī)氮源不能提供白靈菇自身不能合成而生長(zhǎng)發(fā)育所必需的一些氨基酸[23]。

2.3 最佳碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽單因素試驗(yàn)

2.3.1 碳源質(zhì)量濃度對(duì)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵的影響

由圖4可知，當(dāng)可溶性淀粉質(zhì)量濃度達(dá)到3.0g/100mL時(shí)菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高，生物量為0.746g/100mL ，其質(zhì)量濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于白靈菇菌絲體產(chǎn)量的提高，故可溶性淀粉質(zhì)量濃度在2.5～3.5g/100mL為宜。

2.3.2 氮源質(zhì)量濃度對(duì)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵的影響

由圖5可知，當(dāng)牛肉膏質(zhì)量濃度達(dá)到0.50g/100mL 時(shí)菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高，生物量為0.539g/mL，其質(zhì)量濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于白靈菇菌絲體產(chǎn)量的提高，故牛肉膏質(zhì)量濃度在4～6g/L為宜。

2.3.3 無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量濃度對(duì)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵的影響

由圖6可知，當(dāng)磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度達(dá)到0.20g/100mL 時(shí)菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高，為0.621g/100mL ，其質(zhì)量濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于白靈菇菌絲體產(chǎn)量的提高，故磷酸二氫鉀質(zhì)量濃度在0.15～0.25g/100mL 為宜。

2.3.4 硫酸鎂質(zhì)量濃度對(duì)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵的影響

由圖7可知，當(dāng)硫酸鎂質(zhì)量濃度達(dá)到0.25g/100mL 時(shí)菌絲體產(chǎn)量達(dá)到最高，生物量為0.339g/100mL ，其質(zhì)量濃度過(guò)高和過(guò)低都不利于白靈菇菌絲體產(chǎn)量的提高，故硫酸鎂質(zhì)量濃度在0.2～0.3g/100mL為宜。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)優(yōu)化

采用可溶性淀粉為碳源，牛肉膏為氮源，磷酸二氫鉀、硫酸鎂為無(wú)機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行1.3.5節(jié)正交試驗(yàn)(L9(34))，測(cè)定菌絲體干質(zhì)量，結(jié)果和數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表4和圖8。由表4直觀(guān)反映，第7號(hào)實(shí)驗(yàn)組合條件A3B1C3D2的菌絲體生物量最大(0.666g/100mL )，是各實(shí)驗(yàn)組中效果最好的；k值與極差分析顯示，影響菌絲體發(fā)酵的因素主次順序?yàn)椋篈(可溶性淀粉)＞D(硫酸鎂)＞C(磷酸二氫鉀)＞B(牛肉膏)。理論最優(yōu)條件組合為A3B1C3D2，即發(fā)酵培養(yǎng)基中可溶性淀粉、牛肉膏、磷酸二氫鉀和硫酸鎂質(zhì)量濃度分別為3.50、0.40、0.25、0.25g/100mL 時(shí)，發(fā)酵白靈菇生物量最高。而由表4磷酸二氫鉀k值可知，k1和k3數(shù)值基本相等，則磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度可選取水平1(0.15g/100mL)和水平3(0.25g/100mL)，對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，在相同工藝條件下采用發(fā)酵培養(yǎng)基組合A3B1C3D2得發(fā)酵菌絲體干質(zhì)量0.632g/100mL ，高于A3B1C1D2條件下菌絲體干質(zhì)量0.542g/100mL ，故發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方案確定為A3B1C3D2。

2.5 發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)

圖9表明，溫度從24℃上升到26℃的過(guò)程中，菌絲體生物量逐漸升高，增加趨勢(shì)較明顯，可能是由于隨著溫度升高與白靈菇菌絲體細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)的酶活性逐漸增加所致。隨著培養(yǎng)溫度升至26～28℃，菌絲體生物量明顯下降，原因一方面可能是與白靈菇菌絲體細(xì)胞生長(zhǎng)代謝相關(guān)的酶耐熱性差，隨培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，酶活生物量，甚至變性失活；另一方面可能是由于白靈菇屬于低溫型食用菌，菌種在高溫時(shí)大部分已死亡，無(wú)法繼續(xù)生長(zhǎng)。綜合以上分析確定白靈菇發(fā)酵溫度為26℃。

搖床轉(zhuǎn)速直接影響搖瓶通氣量的大小。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速過(guò)低時(shí)，通氣量小，培養(yǎng)基內(nèi)溶氧不足，難以滿(mǎn)足菌絲體對(duì)氧氣的需求；轉(zhuǎn)速過(guò)高則剪切作用增強(qiáng)，增大了對(duì)菌球的機(jī)械刺激，亦不利于菌絲體的生長(zhǎng)[24-25]。圖10表明，在搖床轉(zhuǎn)速160r/min時(shí)，菌絲體生物量最高，轉(zhuǎn)速過(guò)高或過(guò)低均不利于白靈菇菌絲體的生長(zhǎng)。

由圖11可知，從發(fā)酵開(kāi)始至6d左右，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲體生物量呈快速上升趨勢(shì)，發(fā)酵液的pH值則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)；6d之后菌絲體生物量呈緩慢上升直至基本穩(wěn)定，同時(shí)，發(fā)酵液pH值下降趨勢(shì)趨緩至基本穩(wěn)定。6d后白靈菇菌絲體增長(zhǎng)緩慢可能有兩方面的原因：一是再培養(yǎng)過(guò)程中菌絲球直徑增大，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧向內(nèi)傳遞越來(lái)越困難，使得菌絲體增加越來(lái)越困難，進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期；二是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分被不斷消耗，代謝產(chǎn)物不斷積累，使得菌絲體吸收不到足夠的營(yíng)養(yǎng)，生長(zhǎng)緩慢。pH值下降可能是因?yàn)榘嘴`菇菌絲體在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，隨著時(shí)間的推移，酸性物質(zhì)不斷積累，導(dǎo)致培養(yǎng)液內(nèi)pH值不斷下降，最后由于菌絲體受到養(yǎng)分不足和代謝產(chǎn)物等的影響，生長(zhǎng)緩慢并趨于穩(wěn)定，因此，發(fā)酵液內(nèi)的pH值也隨之趨于穩(wěn)定。綜合考慮發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)必將增加生產(chǎn)成本等因素，故將白靈菇菌絲體液體發(fā)酵時(shí)間設(shè)定在7d。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化分析

2.6.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)所確定的水平，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)白靈菇菌絲體發(fā)酵條件進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(表3)，包括12個(gè)析因?qū)嶒?yàn)和3個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。回歸方程的方差分析結(jié)果歸納見(jiàn)表6。

由表6回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果表明，X2、X3、X1

2、X1X2、X22、X3

2項(xiàng)影響是極為顯著(P＜0.01)；由此所建立的模型也是極為顯著(P＜0.01)；X1、X1X3對(duì)白靈菇發(fā)酵產(chǎn)菌絲體生物量的影響為顯著(P＜0.05)；X2X3對(duì)白靈菇發(fā)酵產(chǎn)菌絲體生物量的影響不顯著(P＞0.05)。因此各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系。復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=0.9936，說(shuō)明由這3個(gè)因素及其二次項(xiàng)所建立的模型能解釋白靈菇發(fā)酵產(chǎn)菌絲體生物量變化的99.36%，因此回歸方程給白靈菇發(fā)酵產(chǎn)菌絲體提供了一個(gè)合適的模型。

由表6可知，各因素影響程度主次順序?yàn)椋篨3(發(fā)酵周期)＞X2(搖床轉(zhuǎn)速)＞X1(發(fā)酵溫度)。由上述結(jié)果得出溫度(X1)、搖床轉(zhuǎn)速(X2)、發(fā)酵周期(X3)與菌絲體生物量(Y)的二次多項(xiàng)回歸方程(編碼后)為：Y=1.559767－0.045088 X1＋0.066713 X2＋0.1822 X3－0.131421 X12－0.091925 X1X2＋0.0634 X1X3－0.358571 X22＋0.04395 X2X3－0.153246 X32。

圖12為運(yùn)用SAS軟件分析得到的響應(yīng)面圖，從圖中可以直觀(guān)地看出，各因子對(duì)響應(yīng)值的影響變化趨勢(shì)，而且回歸模型存在最大值，即白靈菇菌絲體生物量在各因素所選擇的范圍內(nèi)存在極值，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)。

為了求出最佳點(diǎn)的編碼值，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)并整理得最佳發(fā)酵條件為溫度(X1)=25.89℃，搖床轉(zhuǎn)速(X2)=163r/min，發(fā)酵周期(X3)=7.48d(即179.52h)，此時(shí)白靈菇菌絲體生物量最大估計(jì)值Y=1.632g/100mL ?？紤]到實(shí)際操作的便利，確定發(fā)酵條件的最佳組合為：溫度26℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，發(fā)酵周期7.5d(即180h)。

2.6.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，用以上得到的最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)5次。得到的白靈菇菌絲體生物量為1.6004g/100mL ，與預(yù)測(cè)值Y=1.632g/100mL 擬合較好，說(shuō)明回歸方程為白靈菇菌絲體發(fā)酵提供了一個(gè)合適的模型。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)從來(lái)自中國(guó)不同產(chǎn)區(qū)的19株白靈菇生產(chǎn)菌種中篩選出河北武安天山2號(hào)，該菌株生長(zhǎng)速率快，品質(zhì)好。

以河北武安天山2號(hào)菌株為實(shí)驗(yàn)菌株，通過(guò)正交設(shè)計(jì)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)軌驅(qū)崿F(xiàn)白靈菇菌絲體深層發(fā)酵工藝的優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分為可溶性淀粉3.50g/100mL 、牛肉膏0.40g/100mL 、磷酸二氫鉀0.25g/100mL 、硫酸鎂0.25g/100mL ，pH值自然；優(yōu)化發(fā)酵條件為溫度26℃、搖床轉(zhuǎn)速160r/min、發(fā)酵周期7.5d(180h)。此條件下發(fā)酵菌絲體生物量可達(dá)到1.6004g/100mL，實(shí)際值較預(yù)測(cè)值小1.94%，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

本實(shí)驗(yàn)為白靈菇菌絲體深層發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用和工藝優(yōu)化研究提供了依據(jù)、方法和途徑。與已有的其他研究結(jié)果相比，本研究簡(jiǎn)化了白靈菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分，縮短了培養(yǎng)周期，降低了液體發(fā)酵的生產(chǎn)成本，對(duì)于生產(chǎn)實(shí)際具有較好參考價(jià)值。

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Strain Screening of Pleurotus nebrodensis and Optimization of Submerged Culture Conditions for Biomass P rodution

JI Hong1,2, ZHAO Li-ming1
(1. Department of Management and Economics, Tianjin University, Tianjin 300072, China；2. School of Biology and Food Engineering, Changshu Insti tute of Technology, Changshu 215500, China)

Pleurotus nebrodensis Tianshan No.2 from Wuan, Hebei province was selected as the fa stest-growing of 19 strains. The culture medium for submerged fermentation of st rain Tianshan No.2 were optimized for the maximum biomass (dry cell weight, DCW) production using an orthogonal a rray design L9(34), and th ree culture conditions including temperature, shaking speed and time were optimized by response surface analysis based on a three-variable, three-level Box-Behnken experimental design. The results showed that the optima l medium composition (per 100 mL) was 3.50 g of soluble starch, 0.40 g of beef extract, 0.25 g of monopotassium phospha te and 0.25 g of magnesium sulfate. The mycelia biomass of strain Tianshan No.2 was 1.6004 g /100 mL after 7.5 d (180 h) of shaking culture at 26 ℃ with a shaking speed of 160 r/min using the optimized medium.

Pleurotus nebrodensis；submerged fermentation ；mycelia biomass ；orthogonal array design；response surface methodology

Q815

A

1002-6630(2013)23-0221-07

10.7506/spkx1002-6630-201323046

2013-06-22

蘇州市科技局應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(SYN201007)

冀宏(1969—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榧夹g(shù)經(jīng)濟(jì)及管理、食用菌工程技術(shù)。E-mail：jihong@cslg. cn