張 匯，王君巧，聶少平，張莘莘，王遠興，謝明勇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

靈芝(Ganoderma lucidum)是一種名貴真菌作物，在我國及其他東亞國家有著2000多年的食用或藥用歷史。如今，靈芝作為膳食補充劑成分，在西方國家也越來越受歡迎[1]。黑靈芝(G. atrum)廣泛種植于我國江西贛南地區(qū)，和赤芝、紫芝等一起構(gòu)成龐大的靈芝家族。近年來，黑靈芝的化學(xué)成分及藥理研究越來越受到人們的關(guān)注。現(xiàn)已證實黑靈芝水提物的主要成分是多糖類化合物，具有抗腫瘤[2]、免疫調(diào)節(jié)[3]及抗氧化[4-5]等廣泛的生物活性。然而，黑靈芝水提之后的殘渣通常以廢物的形式被丟棄，這給黑靈芝資源造成了極大的浪費。

人們普遍認(rèn)為從真菌或植物中提取的β-(1→3)-葡聚糖具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。然而對于α-(1→3)-葡聚糖，因其存在于真菌或植物細(xì)胞壁中，大多不溶于水，且不易用熱水進行提取，被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能，因此對其的研究非常少。事實上，多糖的生物學(xué)功能與其水溶解性、分子質(zhì)量大小、支化度及鏈構(gòu)象等有著緊密的聯(lián)系[6]。低支化度的α-(1→3)-葡聚糖在溶液中呈剛性鏈狀，通常不發(fā)揮生物活性，而通過化學(xué)修飾(如硫酸化、磷酸化等)引入親水性基團，可顯著改善α-(1→3)-葡聚糖的水溶解性，并增強其生物活性[7]。Bao Xingfeng等[8]采用堿液從靈芝孢子粉中提取得到了水不溶性的α-(1→3)-葡聚糖，并證實通過化學(xué)修飾可以顯著增強其免疫調(diào)節(jié)活性。而Zhang Pingyi等[9-10]采用同樣的方法從香菇中提取水不溶性的α-(1→3)-葡聚糖，證實其硫酸化修飾產(chǎn)物具有抗腫瘤活性。

為充分利用和挖掘黑靈芝資源，實驗室前期采用0.5mol/L NaOH溶液從黑靈芝水提殘渣中提取活性成分，得到了一種水不溶性的多糖，經(jīng)證實為一種低支化度的α-(1→3)-葡聚糖。為改善α-(1→3)-葡聚糖的水溶解性，本實驗擬采用氯磺酸-吡啶法對其進行硫酸化修飾，通過凝膠滲透色譜和紅外光譜進行表征，體外抗腫瘤實驗篩選具有高活性的硫酸化多糖，在此基礎(chǔ)上，進一步對篩選出的硫酸化多糖進行分離純化及溶液性質(zhì)分析，為黑靈芝作為新資源食品的開發(fā)及其副產(chǎn)物的綜合利用提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑靈芝水不溶性多糖來源于本實驗室的前期制備：采用0.5mol/L的NaOH溶液在4℃條件下浸提過夜，浸提液經(jīng)中和、離心得到沉淀物，沉淀通過水洗和0.25mol/L LiCl的二甲基亞砜(DMSO)溶液溶解、透析、凍干，得到水不溶性的多糖。該多糖被證明是一種低支化度的α-(1→3)-葡聚糖，在DMSO中呈剛性鏈狀。黑靈芝子實體采集于江西省贛州市，實驗前曬干，切割成小塊，用中藥粉碎機反復(fù)粉碎。

HiLoadTM16/600 SuperdexTM200pg凝膠柱 美國Pharmacia公司；透析袋(截留分子質(zhì)量為3600u) 美國Sigma公司；超純水、乙醇、醋酸、硼氫化鈉、氯磺酸(CSA)、吡啶、無水硫酸鈉、甲酰胺、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸鉀、明膠、氯化鋇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ALPHA 1-2 LD冷凍干燥機 德國Martin Christ公司；ANKE TDL-5-A離心機 上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司；TU-1901紫外雙波長分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀 美國Thermo Electron公司；凝膠排阻色譜與多角度激光光散射聯(lián)用儀(HPSEC-MALLS) (配有Shodex OHpak SB-G保護柱，Shodex OHpak SB-806 HQ (8mm×300mm)，以及HELEOS-Ⅱ激光光散射檢測器(MALLS)，Visco Star-Ⅱ黏度檢測器和Optilab rEX示差檢測器) 美國Wyatt公司。

1.3 方法

1.3.1 正交試驗設(shè)計制備不同酯化度的硫酸化衍生物

采用氯磺酸-吡啶法(CSA-Pyr)對黑靈芝水不溶性多糖進行硫酸化修飾，選取對多糖硫酸化修飾影響較大的CSA與Pyr的體積比(A)，酯化溫度(B)和反應(yīng)時間(C)作為因素進行正交試驗設(shè)計(表1)，設(shè)置三因素三水平L9(33)，并采用明膠比濁法來評價酯化效果。

表 1 三因素三水平L9(33)正交試驗設(shè)計Table 1 Three factors and three levels used in orthogonal array design

1.3.2 酯化試劑的制備

根據(jù)表1設(shè)計，配制5mL的酯化試劑。量取無水吡啶(無水硫酸鈉干燥)，轉(zhuǎn)入250mL三口燒瓶中，冰水浴中緩慢滴加CSA，攪拌，40min內(nèi)加完。滴加完CSA后，再在室溫下攪拌30min，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 多糖硫酸化過程

取水不溶性樣品0.2g，懸浮于20mL無水甲酰胺中，反應(yīng)瓶置于冰浴中，逐滴加入5mL酯化試劑，邊攪拌邊加入，按條件在三口燒瓶中進行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，離心除去不溶物，上清液置于透析袋中透析3d。將透析內(nèi)液旋轉(zhuǎn)濃縮至10～20mL，乙醇沉淀，離心，沉淀物用無水乙醇反復(fù)洗滌、凍干，得到不同酯化度的硫酸化多糖樣品。

1.3.4 硫酸化多糖酯化度的測定

以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)，采用明膠比濁法[11]測定硫酸基團的含量，按照公式(1)計算酯化度。

式中：DS表示酯化度；C表示硫元素含量/%。

同時以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用苯酚-硫酸法測定不同硫酸化多糖的總糖含量。

1.3.5 硫酸化多糖紅外光譜分析

取適量硫酸化多糖樣品(充分干燥粉末)，以KBr混合研磨成粉，壓片，在400～4000cm-1范圍內(nèi)掃描紅外光譜圖。

1.3.6 不同硫酸化多糖體外抗腫瘤活性篩選

S-180肉瘤細(xì)胞進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期良好的細(xì)胞液收集于離心管中以1200r/min離心5min，棄上清液，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×105個/mL后，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100L；然后將不同體積的硫酸化多糖溶液加入孔板中，使終體積為200L，終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400μg/mL，以用含10%的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)的S-180細(xì)胞為對照，每組設(shè)5個復(fù)孔，在37℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。用MTT法在570nm處測定細(xì)胞存活度，按照公式(2)計算抑制率，所有數(shù)據(jù)進行t檢驗。

式中：A給藥組和A對照組分別表示給藥組和對照組的吸光度。

1.3.7 高活性硫酸化多糖的分離純化及純度鑒定

采用HiLoadTM16/600 SuperdexTM200pg凝膠柱(16mm×60cm)對高活性的硫酸化多糖進行分離純化。經(jīng)初步摸索，確定洗脫條件為：多糖質(zhì)量濃度為4mg/mL，洗脫液為超純水，流速0.6mL/min，進樣量1mL，6min/管進行收集，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集峰尖各管，用超純水透析2d，濃縮，凍干得到純度較高的硫酸化多糖。

采用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)鑒定硫酸化多糖的純度。色譜條件：Agilent 1200液相系統(tǒng)，配有BIDNDC/GPC檢測器，PL柱(PL aquagel-OH 60 8μm)。將樣品配成1mg/mL的水溶液，進樣100μL，以0.02% NaN3溶液為流動相，流速0.6mL/min，柱溫35℃，數(shù)據(jù)采集時間30min，BIC ParSEC Chromatography Software采集信號，觀察樣品的色譜峰。

1.3.8 高活性硫酸化多糖的溶液性質(zhì)

采用高效凝膠滲透色譜與多角度激光光散射聯(lián)用技術(shù)(HPSEC-MALLS)測定硫酸化多糖的分子質(zhì)量及其分布。色譜條件為：色譜柱：Shodex OHpak SB-G保護柱與Shodex OHpak SB-806 HQ分析柱串聯(lián) (8mm×300mm)，檢測器：HELEOS-Ⅱ激光光散射檢測器(MALLS)，Visco Star-Ⅱ黏度檢測器和Optilab rEX示差檢測器，流動相為0.1mol/L NaNO3溶液(含有0.02%的NaN3)，流速為0.6mL/min，柱溫35℃，檢測器溫度為25℃，數(shù)據(jù)采集時間為60min，樣品溶液的示差折光指數(shù)增量DN/DC取0.146，ASTRA軟件采集并分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸酯化修飾結(jié)果

多糖的硫酸化修飾有多種方法，但對于吡喃型多糖，氯磺酸-吡啶法最為常見和適用[12]，在這個反應(yīng)中，以CSA和Pyr的體積比、反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度3個因素對酯化效果影響最大[13]。因此，本實驗以這3個因素進行正交試驗設(shè)計，以酯化度(DS)、糖含量和凝膠滲透色譜行為作為指標(biāo)評價黑靈芝水不溶性葡聚糖的硫酸化修飾條件，結(jié)果見表2和圖1。

表 2 硫酸化修飾正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results for sulfated modification

圖 1 黑靈芝水不溶性葡聚糖硫酸化修飾產(chǎn)物凝膠滲透色譜行為Fig.1 HPSEC curve of sulfated derivatives of water-insoluble glucan from Ganoderma atrum

由表2可知，不同條件下得到的修飾產(chǎn)物酯化度不同，當(dāng)CSA與Pyr的體積比為1:2時，酯化效果最好；當(dāng)CSA比例偏高時(1:1)，由于酯化試劑發(fā)生結(jié)塊現(xiàn)象，CSA不能很好的發(fā)揮其活性，從而酯化效果不佳[11]；當(dāng)CSA比例降低時(1:4)，溫度和時間的影響得到加強。最終通過正交試驗得到了9個不同酯化度的硫酸化修飾產(chǎn)物。以酯化度(DS)為指標(biāo)，對正交試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)酯化試劑比例(A)的極差最大，其次是反應(yīng)溫度(B)和反應(yīng)時間(C)，所以各因素對DS的影響程度依次為A＞B＞C，最佳組合為A2B3C3。表3方差分析結(jié)果表明，3個因素對酯化度的影響都沒有顯著性差異(P＞0.05)，因此，可根據(jù)實際情況來確定硫酸化修飾條件。驗證實驗結(jié)果表明：最佳組合A2B3C3得到的修飾產(chǎn)物酯化度為1.30，與組合A2B3C2的結(jié)果無顯著性差異，考慮到酯化時間過長可能對多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此，本實驗選擇A2B3C2組合作為最佳的硫酸化修飾條件。

從糖含量來看，不同酯化條件得到的硫酸化多糖其糖含量不同，且對于相同CSA比例的修飾產(chǎn)物，酯化度越高，其糖含量也相對增加，但差異不大。與硫酸化修飾前的AGAP樣(糖含量為98.2%)進行比較發(fā)現(xiàn)，硫酸化修飾后糖含量都顯著下降，這是因為硫酸化修飾產(chǎn)物結(jié)合上新的硫酸基團，相應(yīng)的糖含量自然會有所下降[14]。

表 3 硫酸化修飾正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance for sulfated modification

修飾產(chǎn)物的凝膠滲透色譜(HPGPC)行為分析發(fā)現(xiàn)，雖然在設(shè)定的最佳酯化A2B3C2條件下，得到AGAPS6酯化度最高(DS 1.28)，但多糖分子鏈發(fā)生了一定的化學(xué)降解，而在其他條件下均未發(fā)生這種降解，表現(xiàn)為單一的色譜峰。這表明，在酯化過程中，苛刻的反應(yīng)條件(如高溫和高氯磺酸比例)會對多糖分子鏈產(chǎn)生一定的影響，并有降解糖鏈的趨勢；本實驗除AGAPS6外，其他酯化條件對黑靈芝水不溶性葡聚糖都沒有造成結(jié)構(gòu)的破壞，反應(yīng)過程較為溫和。

圖 2 黑靈芝水不溶性葡聚糖硫酸化修飾產(chǎn)物紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of sulfated derivatives of water-insoluble glucan from Ganoderma atrum

由圖2可知，硫酸酯化后的多糖保留了多糖母體特征吸收峰，主要差別在1260cm-1和820cm-1附近。硫酸酯化前的AGAP這兩處均無特征吸收，經(jīng)硫酸化后出現(xiàn)強吸收峰。其中1260cm-1為S＝O的伸縮振動，820cm-1為糖環(huán)C-O-S的伸縮振動的特征峰[15]。此外3400cm-1附近的羥基吸收峰有所降低，表明部分羥基已被酯化，以上結(jié)論表明硫酸酯基已連接在多糖鏈上。

綜上分析，本實驗根據(jù)酯化度大小和多糖結(jié)構(gòu)完整性選擇了酯化度最低(AGAPS7)、最高(AGAPS5)和中等(AGAPS3)的3個樣品作為進一步研究的對象，探討硫酸化修飾產(chǎn)物的體外抗腫瘤活性及不同酯化度對抗腫瘤活性的影響，旨在篩選出具有高活性的硫酸化多糖。

2.2 硫酸化修飾產(chǎn)物體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果

硫酸化修飾能增強多糖的生物活性，部分研究成果也已進入臨床應(yīng)用[16]。研究表明，硫酸化多糖在抗腫瘤活性方面有著顯著的增強作用，如對S-180肉瘤細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞SGC-790和肝癌細(xì)胞HepG2等都有直接的殺傷作用[17-18]。由圖3可知，AGAPS3、AGAPS5和AGAPS7對S-180肉瘤細(xì)胞的生長有顯著的抑制作用，且成劑量依賴關(guān)系。從酯化度來看，AGAPS5 (DS=1.14)的抑制作用最明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度達到400μg/mL時，抑制率達到67.74%，而AGAPS3(DS=0.74) 和AGAPS7 (DS=0.35)在相同質(zhì)量濃度下的抑制率分別為42.44%和33.70%，這表明硫酸化多糖對S-180肉瘤細(xì)胞的抑制作用與酯化度成正相關(guān)。

圖 3 不同酯化度硫酸化多糖對S-180肉瘤細(xì)胞生長的抑制作用Fig.3 Inhibitory effects of sulfated polysaccharides with different DS on the growth of S-180 sarcoma cells

因此，本實驗篩選酯化度高、抑制腫瘤細(xì)胞生長強的AGAPS5(DS=1.14)作為進一步的研究對象，對其進行分離純化和溶液性質(zhì)的分析。

2.3 高活性硫酸化多糖的分離純化及純度鑒定

采用Superdex G 200pg凝膠柱對AGAPS5進行分離純化，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，其洗脫曲線如圖4所示。

圖 4 AGAPS5在HiLoadTM 16/600 Superdex G 200pg凝膠柱上的洗脫曲線(A)及純度鑒定(B)結(jié)果Fig.4 Elution curve of AGAPS5 on HiLoadTM 16/600 Superdex G 200 pg column (A) and purity identification (B)

由圖4可知，柱分離可得到兩個不同組分的酯化多糖，而以第一個組分為主，將之命名為AGAPS5-1，得率為20.42%。經(jīng)高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)鑒定，AGAPS5-1的色譜峰為單一正態(tài)峰，證明其為高純度的硫酸化多糖。

2.4 溶液性質(zhì)分析結(jié)果

高效凝膠滲透色譜(HPSEC)與多檢測器聯(lián)用技術(shù)為高分子溶液的表征提供了方便。HPSEC與多角度光散射檢測器(MALLS)和示差檢測器(RID)聯(lián)用被認(rèn)為是測定多糖分子質(zhì)量的絕對方法[19]，而與黏度檢測器的聯(lián)用能提供多糖每個分子質(zhì)量片段的特性黏度[η]，從而能方便的計算出Mark-Houwink方程，并由此來判斷分子在溶液中的構(gòu)象行為。采用HPSEC-MALLS-RID-Vis聯(lián)用技術(shù)測定了AGAPS5-1的分子質(zhì)量及其分布等，結(jié)果見表4。

表 4 高活性硫酸化純多糖(AGAPS5-1)的分子質(zhì)量、分布及特性黏度分析結(jié)果Table 4 Molecular weight (Mw) distribution and intrinsic viscosity of AGAPS5-1

由表4可知，AGAPS5-1的Mw和Mn分別為5.19×104u和2.63×104u，多分散性系數(shù)PI為1.97，表明AGAPS5-1是寬分布的大分子物質(zhì)；AGAPS5-1的z-均回旋半徑＜S2＞z1/2為38.3nm，特性黏度[η]為27.28mL/g，根據(jù)體積排阻計算得到的Mark-Houwink方程指數(shù)α=0.623，表明AGAPS5-1在0.1mol/L NaNO3(含有0.02%的NaN3)溶液中呈無規(guī)線團分散[7]。由于硫酸基團的加入，硫酸化修飾能改變多糖在溶液中的構(gòu)象行為，并最終導(dǎo)致理化性質(zhì)及生物活性的改變[10,20]。黑靈芝水不溶性葡聚糖經(jīng)硫酸化修飾后，由剛性鏈狀變成無規(guī)線團分布，改善了其在水中的溶解性，從而為水不溶性多糖的研究開發(fā)和商業(yè)應(yīng)用提供了可能和方便。

3 結(jié) 論

采用氯磺酸-吡啶法對黑靈芝水不溶性葡聚糖進行硫酸酯化修飾，得到9種不同酯化度的水溶性修飾產(chǎn)物，通過凝膠色譜行為和對腫瘤細(xì)胞毒性作用的研究，篩選了具有高活性的硫酸化多糖AGAPS5作為進一步研究的對象，其酯化度為1.14，糖含量為66.3%，對S-180肉瘤細(xì)胞生長的抑制率為67.74%。經(jīng)HiLoadTM16/600 SuperdexTM200pg凝膠柱分離純度得到高純度的AGAPS5-1，HPSECMALLS聯(lián)用技術(shù)分析表明AGAPS5-1在0.1mol/L NaNO3溶液中的Mw和Mn分別為5.19×104u和2.63×104u，呈多分散性，以無規(guī)線團狀形式存在。本研究表明硫酸化修飾能改善黑靈芝水不溶性葡聚糖的水溶解性和溶液性質(zhì)，增強體外抗腫瘤活性，為黑靈芝作為新資源食品的開發(fā)及其副產(chǎn)物的綜合利用提供了新的研究思路。

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