李 雪，牟光慶，陳歷俊，* ，姜鐵民

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034;2.北京三元食品股份有限公司，北京100076)

環(huán)境雌激素［1-2］屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是指由于人類活動(dòng)而釋放到環(huán)境中的一類有害化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)進(jìn)入生物體后能夠擾亂生物體內(nèi)分泌功能，通常被稱為“外因型內(nèi)分泌擾亂化學(xué)物質(zhì)”。原料奶的質(zhì)量是乳制品的根本，是保證奶制品食用安全、維護(hù)人類健康的基礎(chǔ)。原料乳中是否存在雌激素至關(guān)重要，其中若殘留激素，則對(duì)人體有一定的毒性［3］。本研究對(duì)原料乳中5 種雌激素進(jìn)行了分析檢測(cè)，其中既有內(nèi)源性雌激素(雌酮、雌二醇和雌三醇)也有環(huán)境雌激素(己烯雌酚和雙酚A)，都屬于人工合成或自然界存在的，它們可通過食物鏈或直接接觸等多種途徑進(jìn)入體內(nèi)，模擬動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源性激素，具有協(xié)同或拮抗正常的內(nèi)源性激素的作用，干擾內(nèi)分泌功能，多被稱為環(huán)境雌激素。近來，對(duì)牛乳中環(huán)境激素檢測(cè)的研究較多，常用的方法有:氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法、高效液相色譜(HPLC)法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法、熒光分析法等［4-11］。例如張紅英等人［11］的研究是在有機(jī)溶劑提取的基礎(chǔ)上對(duì)樣品進(jìn)行衍生，然后采用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)原料乳，但是前處理過程復(fù)雜，并且接觸大量的有毒試劑，需要長(zhǎng)時(shí)間的衍生化過程。而本文用固相萃取替代衍生過程，優(yōu)化了提取、凈化、色譜測(cè)定等參數(shù)，成功建立了固相萃取、LC-MS 測(cè)定原料乳中5 種環(huán)境雌激素殘留量的方法。不僅提高了分析樣品的工作效率，還在優(yōu)化前處理方法的基礎(chǔ)上，取得了比較滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料奶 采自北京市11 個(gè)不同的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng);雌三醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度97.4%、雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品 純度96.7% 中國(guó)藥品生物制品檢定所;雌酮標(biāo)準(zhǔn)品 純度99.5%、雙酚A 標(biāo)準(zhǔn)品純度98.5%德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司;己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品 純度99.7%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;甲醇HPLC 級(jí)、乙腈LC/MS級(jí) 美國(guó)Fisher 公司;氮?dú)?、氬?＞99.999%);超純水 美國(guó)Milli-Q 純水系統(tǒng)制;其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

ACQUITY Ultra Performance LCTM 超高效液相色譜儀、Quattro Premier Micromass 質(zhì)譜儀、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 美國(guó)Waters 公司;KQ-500DE 醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Sigma 2K-15 高速冷凍離心機(jī) 博勱行儀器有限公司;Cleanert NH2-SPE 固相萃取柱 500mg/3mL 美國(guó)Agela 公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52A 上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHB-Ⅲ型水循環(huán)真空泵 鄭州市上街區(qū)儀器廠。

1.2 LC-MS/MS 條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLCTM HSS T3(2.1 ×50mm，1.8μm);流動(dòng)相:乙腈-甲醇(4∶1，A)與0.01%氨水(B)，流速0.3mL/min，梯度洗脫程序見表1;柱溫35℃;樣品室溫度25℃;進(jìn)樣量為10μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 The program of gradient elution

1.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源;負(fù)離子掃描模式;毛細(xì)管電壓2.37kV;離子源溫度120℃;去溶劑氣溫度450℃;去溶劑氣流量800L/h;錐孔氣流量50L/h;碰撞氣體為氬氣，碰撞氣流速度為0.14mL/min，多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)模式檢測(cè)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg 于10mL 容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋定容，得到質(zhì)量濃度為1.0g/L 的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別取上述儲(chǔ)備液用乙腈-水(1∶1，v/v)或乙腈-0.01%氨水(1∶1，v/v)稀釋為1mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用來優(yōu)化質(zhì)譜條件。

各取單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用初始流動(dòng)相做稀釋液配制所需濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

量取2mL 原料奶樣品于15mL 離心管中，加入10mL 乙腈，漩渦混勻1min，于25℃超聲25min，在4℃下以12000r/min 離心10min，移取上清液，待上清液恢復(fù)至室溫后過NH2柱。在NH2柱中加入約2cm高無(wú)水硫酸鈉(經(jīng)650℃烘烤4h，保存在干燥器內(nèi)，冷卻后備用)，下接旋轉(zhuǎn)瓶放在固定架上。加樣前先用4mL 乙腈-甲苯(3∶1)預(yù)洗柱，當(dāng)液面到達(dá)硫酸鈉的頂部時(shí)，迅速將上清液轉(zhuǎn)移到凈化柱上，再用25mL 乙腈-甲苯(3∶1)洗滌柱子，收集所有流出物于旋轉(zhuǎn)瓶中并在40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至近干。用1mL 乙腈/甲醇4∶1-0.01%氨水(2∶3，v/v)溶液溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22μm 濾膜過濾，移入1.5mL 自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，供HPLC-MS/MS 測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法的選擇

2.1.1 提取溶劑的選擇 這5 種環(huán)境雌激素都屬于疏水性有機(jī)化合物，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑。本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取方式對(duì)樣品進(jìn)行提取，先后比較了甲醇、叔丁基甲醚、乙腈和乙酸乙酯4 種溶劑的提取效果，得到5 種環(huán)境雌激素的回收率，如圖1 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈能有效沉淀蛋白質(zhì)，其總提取效率最高，且提取液清澈，本地干擾少;由于牛乳本身含有很多脂溶性化合物，以叔丁基甲醚和乙酸乙酯為提取劑時(shí)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，即使在12000r/min 條件下離心10min 也不能很好的消除乳化現(xiàn)象，從而造成提取液中含有大量的雜質(zhì)，給接下來的凈化工作帶來了很大的困難，而且乙酸乙酯提取環(huán)境雌激素的回收率低于20%;甲醇提取效果沒有乙腈好，且甲醇很難與水相分層，提取液中殘存少量雜質(zhì)，不利于凈化過程，易造成固相萃取小柱堵塞。實(shí)驗(yàn)也考察了在提取過程中加入三氯乙酸和0.1%乙酸溶液對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪的沉淀效果，以期能得到更純凈的提取液，結(jié)果表明，加入0.1%乙酸溶液的樣品過固相萃取柱時(shí)會(huì)使小柱堵塞;而加入三氯乙酸溶液的樣品提取率反而降低，因此，選擇乙腈作為本實(shí)驗(yàn)的提取溶劑。通過不同提取溫度(20、25、30℃)和超聲時(shí)間(20、25、30min)對(duì)提取效率的影響發(fā)現(xiàn)，在25℃下超聲25min 時(shí)提取效率最高，故本實(shí)驗(yàn)選擇在此條件下進(jìn)行提取。

2.1.2 固相萃取凈化條件的選擇 通過實(shí)驗(yàn)，比較了PEP 柱、C18柱和NH2柱的凈化效果，發(fā)現(xiàn)3 種固相萃取小柱對(duì)這5 種化合物有不同的吸附能力，回收率范圍在25%～105%之間，其中NH2小柱的平均回收率最高，均在68%以上，且結(jié)果穩(wěn)定，見圖2。這可能是由于NH2柱作為正相萃取柱，其鍵合硅膠填料極性相對(duì)較強(qiáng)，更適合從非極性溶劑中提取弱極性到中等極性物質(zhì)，通過用非極性有機(jī)溶劑活化和洗脫，能很好地將目標(biāo)物洗脫下來，而牛乳中強(qiáng)極性表面活性物質(zhì)仍吸附在小柱上，再通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和溶劑交換，可以除去樣品中的非極性干擾物質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道，采用C18或HLB 柱凈化激素類藥物時(shí)，上樣溶液的組成影響回收率和凈化效果，而通常采用再與NH2柱雙結(jié)合的方式進(jìn)一步進(jìn)化［12］。通過實(shí)驗(yàn)證明，乙腈不僅洗脫回收率高，凈化效果也好，且只需NH2柱即可達(dá)到凈化目的，因此本實(shí)驗(yàn)選擇NH2柱為固相萃取凈化小柱。

圖1 提取溶劑對(duì)牛奶樣品中5 種環(huán)境雌激素回收率的影響Fig.1 Influence of selected solvents on the recoveries of 5 environmental estrogens in bovine milk

圖2 固相萃取柱對(duì)牛奶樣品中5 種環(huán)境雌激素回收率的影響Fig.2 Influence of solid phase extraction columns on the recoveries of 5 environmental estrogens in bovine milk

2.2 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)證明，反相HPLC 技術(shù)用于這5種環(huán)境雌激素的分析檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上選用ACQUITY UPLCTM HSS T3柱(2.1 ×50mm，1.8μm)和ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1 ×50mm，1.7μm)作為分離色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。文獻(xiàn)中報(bào)道，BEH C18色譜柱屬三鍵鍵合，適合在負(fù)離子電離模式條件下對(duì)激素類物質(zhì)的檢測(cè)［8］，但由于不同的色譜柱對(duì)同一樣品有不同的保留時(shí)間，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證明，HSS T3柱由于填料顆粒細(xì)，使峰形更加對(duì)稱尖銳、信噪比更高，比BEH C18柱更適合用于疏水性物質(zhì)的分離檢測(cè)，且能將這5 種目標(biāo)物質(zhì)全部分離，分析時(shí)間更短，8.5min即可完成5 種物質(zhì)的全部分離檢測(cè)，因此選用ACQUITY UPLCTM HSS T3柱作為分離色譜柱。

實(shí)驗(yàn)研究比較了在甲醇-水、乙腈-水二元溶劑體系，以及流動(dòng)相體系中分別加入0.1% 甲酸、10mmol/L 乙酸銨、0.1%氨水、0.01%氨水等對(duì)這5 種環(huán)境雌激素電離噴霧的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以乙腈為流動(dòng)相的各環(huán)境雌激素信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度稍遜于甲醇，但是峰形比甲醇要好，且保留時(shí)間早，而在乙腈中加入一定比例的甲醇，效果更佳。在流動(dòng)相中加入0.01%氨水后流動(dòng)相的pH 為9 左右，色譜柱HSS T3具有較寬的pH 應(yīng)用范圍，且分離這5 種環(huán)境類激素時(shí)柱效高，這與文獻(xiàn)中所報(bào)道的效果基本一致［12］，故最終決定以乙腈/甲醇(4 ∶1)-0.01%氨水作為流動(dòng)相，此時(shí)可以得到最優(yōu)的色譜分離效果和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)，獲得對(duì)稱、尖銳的峰形，且基線平穩(wěn)。這5 種環(huán)境雌激素的MRM 色譜圖見圖3。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，由于這5 種環(huán)境雌激素的分子結(jié)構(gòu)中含有大量的-OH，易于脫去一個(gè)H 而形成［M-H］-離子峰，故選擇在電噴霧負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，考察質(zhì)譜響應(yīng)。然后對(duì)雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚和雙酚A 進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，最終選擇離子豐度高、基線噪音低的2 對(duì)離子，同時(shí)進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量、質(zhì)譜分辨率等質(zhì)譜參數(shù)，使各個(gè)離子的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)達(dá)到最高。然后對(duì)離子源溫度、去溶劑氣溫度及流量、錐孔氣流量進(jìn)行優(yōu)化，使離子化效率達(dá)到最佳。優(yōu)化的質(zhì)譜條件見表2。這與文獻(xiàn)中報(bào)道的質(zhì)譜條件相一致［5-6］。

表2 5 種環(huán)境雌激素的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 2 MS parameters for the determination of 5 environmental estrogens

2.4 方法的定性、定量、線性范圍和檢出限

精確配制一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，由實(shí)驗(yàn)得出的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOD 和LOQ 如表3。其中，以3 倍信噪比(S/N)為方法檢出限(LOD)，10 倍信噪比(S/N)為方法定量限(LOQ)，經(jīng)樣品添加實(shí)驗(yàn)確定各物質(zhì)的檢出限和定量限。

2.5 方法的添加回收率與精密度

本實(shí)驗(yàn)采取外標(biāo)定量法，在空白樣品中添加目標(biāo)化合物，對(duì)原料奶分別進(jìn)行添加回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，樣品中添加不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本實(shí)驗(yàn)前處理方法進(jìn)行處理，用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。在低濃度、中濃度、高濃度3 個(gè)添加水平范圍內(nèi)測(cè)定平均回收率(每個(gè)添加濃度平行測(cè)試6次)，其平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表4，內(nèi)源性激素需扣除空白值。樣品加標(biāo)色譜圖見圖4。

表3 5 種環(huán)境雌激素的回歸分析、檢出限和定量限Table 3 Regression analysis，limits of detection(LOD，S/N=3)and limits of quantification(LOQ，S/N=10)of 5 environmental estrogens

圖3 5 種環(huán)境雌激素的MRM 圖Fig.3 MRM of 5 environmental estrogens

表4 原料奶基質(zhì)中5 種環(huán)境雌激素的添加回收率和精密度(n=6)Table 4 The recoveries and accuracies of 5 environmental estrogens in bovine milk(n=6)

圖4 牛奶樣品加標(biāo)色譜圖Fig.4 Standard chromatogram of the milk sample

2.6 樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)來自11 個(gè)不同養(yǎng)殖場(chǎng)的原料奶進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果顯示，選擇的11 個(gè)原料奶樣本中6 個(gè)樣本中檢測(cè)出雌酮(2.1～4.3μg/L)，3 個(gè)樣本中檢測(cè)出己烯雌酚(2.4～4.6μg/L)，5 個(gè)樣本中檢測(cè)出雙酚A(3.9～4.2μg/L)，其他激素均為未檢出。其中，雌酮的含量屬于內(nèi)源性激素范圍，檢出結(jié)果與文獻(xiàn)［12］報(bào)道牛奶中內(nèi)源性激素含量一致;而己烯雌酚和雙酚A 的痕量存在也是極有可能的，由于養(yǎng)殖場(chǎng)的微環(huán)境因素(土壤、空氣、水源)的影響，這兩種物質(zhì)通過富集等途徑殘存在環(huán)境中，又被植物吸收，極有可能會(huì)在奶牛體內(nèi)得以轉(zhuǎn)換和富集，而且在實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過程中，不可避免的會(huì)使用塑料制品(如儀器管路，離心管等)，而奶樣的前處理過程中又大量使用了有機(jī)溶劑，會(huì)使塑料制品中存在的痕量雙酚A部分溶出，進(jìn)入所測(cè)樣品中，故雙酚A 的含量在允許范圍內(nèi)存在，這與文獻(xiàn)［11］中的檢測(cè)結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

本研究以原料奶為基質(zhì)，詳細(xì)研究了樣品的前處理方法，優(yōu)化了高效液相色譜分離條件和串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件，建立了固相萃取凈化與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法多組分同時(shí)檢測(cè)原料奶中5 種環(huán)境雌激素的分析方法，該方法采用外標(biāo)法定量，保證了方法的準(zhǔn)確性。本方法操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、分析時(shí)間短、回收率較好、結(jié)果準(zhǔn)確且方法穩(wěn)定，適合于大批量樣品的快速檢測(cè)。在當(dāng)今乳制品質(zhì)量安全備受關(guān)注的環(huán)境下，該方法能為牛乳中環(huán)境雌激素的監(jiān)管與監(jiān)督提供技術(shù)依據(jù)，且可應(yīng)用于牛奶的實(shí)際檢驗(yàn)工作和產(chǎn)品質(zhì)量控制，有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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