孫月娥，呂丹娜，王衛(wèi)東，高明俠，*

(1.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院，江蘇徐州221111;2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州221111)

大蒜(Allium Sativum L.)，別名獨(dú)蒜、胡蒜等，是百合科蔥屬一至二年生草本植物。大蒜不但可以作為調(diào)味品，而且具有行滯氣、暖脾胃、消淤積之功效，是一種良好的藥食兼用的植物性食物。但是，大蒜本身帶有辛辣味和強(qiáng)烈的刺激性臭味，很大程度上影響了其食療價(jià)值的充分發(fā)揮。為了克服大蒜及其制品的缺點(diǎn)，近年來在日本和韓國出現(xiàn)了一種新型大蒜產(chǎn)品，即“黑蒜”(Black Garlic)。它是將完整大蒜(帶外皮)在一定條件下經(jīng)過較長時(shí)間的美拉德反應(yīng)，使整個(gè)蒜瓣都呈現(xiàn)出黑色。黑蒜酸甜適口，口感柔軟類似果脯，直接食用時(shí)很少甚至沒有辛辣味，而且食后沒有吃生大蒜所特有的蒜臭氣味，同時(shí)也不會(huì)對(duì)腸胃產(chǎn)生不良刺激。據(jù)報(bào)道，黑蒜具有極強(qiáng)的抗氧化活性，可以減少糖尿病的發(fā)生，大大提高人體免疫力，并且其生理活性遠(yuǎn)高于美拉德反應(yīng)前的新鮮大蒜［1-2］。祝炳俏等［3］分別將黑蒜和白蒜對(duì)小鼠灌胃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑蒜的抗氧化活性明顯高于白蒜。周廣勇等［4］研究了黑蒜貯藏期間的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其在貯藏初期是升高的，隨著時(shí)間的進(jìn)行在逐漸降低，但仍然高于白蒜的抗氧化活性。目前對(duì)老化大蒜提取物的抗氧化活性研究比較多，但是關(guān)于黑蒜抗氧化活性的文獻(xiàn)報(bào)道比較少，并且有研究者將黑蒜與老化大蒜提取物等同［1］。實(shí)際上二者的制備方法并不相同，是否具有同樣的抗氧化活性還需要進(jìn)一步研究。本文對(duì)黑蒜的多種抗氧化活性進(jìn)行研究，并初步探討抗氧化活性與多酚和羥甲基糠醛的關(guān)系，為更好的加工高品質(zhì)的黑蒜提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜 市購;1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)Sigma 公司;硫代巴比妥酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;卵磷脂(生物試劑) 成都市科龍化工試劑廠;其他試劑 分析純。

722G 型分光光度計(jì)、PHS-3C 精密pH 計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DL-5 低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑蒜的制備 新鮮大蒜→挑選→去蒂并剝?nèi)ネ鈱悠?留下三層皮)→放入密閉容器中于70℃下烘28d。

1.2.2 多酚含量的測(cè)定 福林-酚法［5］。

1.2.3 5-羥甲基糠醛(HMF)含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取3g 的大蒜勻漿于250mL 的三角瓶中，加入30mL70%甲醇，用超聲波提取30min，抽濾。濾渣再提取一次，合并提取液并用70%甲醇定容至250mL。取2mL 待測(cè)樣品2 份于試管中，分別加入5mL 0.1g/mL 對(duì)甲基苯胺，在一個(gè)試管中加入1mL 70%甲醇作空白溶液，另一試管中加入1mL 5mg/mL 巴比妥酸，測(cè)定550nm處的吸光值［6-7］。采用5-HMF 為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，含量在0～100μg 之間。按照式(1)計(jì)算5-羥甲基糠醛的含量:

式中，X 為5-HMF 的含量(μg/g)，A0為空白樣中的5-HMF 含量(μg)，Ai為樣品中5-HMF 的含量(μg)，V1為樣品總體積(mL)，V2為測(cè)定所取樣品體積(mL)，m 為樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4 大蒜乙醇提取物的制備 分別準(zhǔn)確稱取5g 不同時(shí)期的大蒜于250mL 三角瓶中，按料液比1 ∶11(g∶mL)加入70%乙醇，超聲(功率40W)提取45min，抽濾。濾液用70%乙醇定容至100mL 后放于冰箱中冷藏備用。

1.2.5 乙醇提取物還原能力的測(cè)定 還原能力采用普魯士蘭法測(cè)定［8-9］。分別取不同時(shí)期的大蒜乙醇提取物0.5mL 于5 支具塞試管中，然后加入0.2mol/L、pH6.6 的磷酸鹽緩沖液2.5mL 和1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合均勻，于50℃保溫25min 后迅速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL，混合后以3000r/min離心8～12min。取上清液2.5mL，加2.5mL 蒸餾水和1mL 0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10min后，于700nm 處測(cè)定吸光值。吸光值越大，還原能力越強(qiáng)。

1.2.6 乙醇提取物在卵磷脂脂質(zhì)體中抗氧化能力的測(cè)定 采用硫代巴比妥酸法(TBA 法)測(cè)定大蒜乙醇提取物的抗氧化性［10］。稱取15g 三氯乙酸(TCA)，0.37g 巴比妥酸(TBA)，2.1mL 濃鹽酸依次加入100mL 水中，配制為TCA-TBA-HCl 混合液。在具塞試管中依次加入10mg/mL 的卵磷脂磷酸鹽緩沖溶液(PBS)1mL、400μmol/L 三 氯 化 鐵 溶 液1mL、400μmol/L 抗壞血酸1mL 和大蒜乙醇提取物1mL，混勻后于37℃下避光水浴60min，再加入2mL TCATBA- HCl 混合液，沸水浴10min，迅速冷卻后以3000r/min 離心10min，取上清液在532nm 處測(cè)吸光值A(chǔ)s，空白管以1mL 雙蒸水代替1mL 的大蒜乙醇提取物，操作方法同上，測(cè)得的即為空白管的吸光值A(chǔ)c。按式(2)計(jì)算大蒜醇提物對(duì)脂質(zhì)體過氧化的抑制率I:

1.2.7 清除羥基自由基能力的測(cè)定 采用鄰二氮菲-Fe2+自氧化法(Fenton 法)測(cè)定［11-12］。移取1mL 2.5mmol/L 的鄰二氮菲溶液于具塞試管中，然后分別依次加入2mL pH7.40 的磷酸緩沖溶液和1mL 蒸餾水，充分混勻后，加入1mL2.5mmol/L FeSO4溶液，混勻后，加入1mL 0.01% H2O2溶液，于37℃恒溫水浴中反應(yīng)60min 后，在536nm 迅速測(cè)其吸光值，所得的吸光值為損傷管的吸光度A損。以1mL 蒸餾水代替損傷管中的1mL 0.01% H2O2溶液，操作方法同損傷管，即可測(cè)得未損傷管的吸光度A未。樣品管以1mL大蒜醇提物代替損傷管中的1mL 蒸餾水，可測(cè)得樣品管的吸光度A樣。按式(3)計(jì)算大蒜對(duì)羥基自由基的清除率I:

1.2.8 清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定 鄰苯三酚自氧化法［13-15］。于兩支具塞試管中分別加入pH8.2 的Tris-HCl 緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)3mL，一支試管中加入0.5mL 樣液和0.5mL 蒸餾水，另一只試管中加入1mL 蒸餾水作為對(duì)照，充分混勻并于25℃保溫25min，然后加入40μL 45mmol/L 鄰苯三酚溶液，迅速混勻，在325nm 處每隔30s 讀取吸光值，反應(yīng)時(shí)間為4min。按式(4)計(jì)算大蒜對(duì)超氧陰離子的清除率I:

式中ΔA0為加入蒸餾水后的鄰苯三酚自氧化速率，即每分鐘吸光值的平均變化率，ΔA 為加入大蒜醇提物后的鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.9 大蒜清除DPPH·能力的測(cè)定 按照表1 程序加樣，反應(yīng)30min 后，在517nm 處測(cè)定吸光值，按式(5)計(jì)算清除率 I，并計(jì)算半數(shù)抑制率濃度IC50［16-18］:

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)期間大蒜總酚含量的變化

美拉德反應(yīng)期間大蒜中總酚含量隨時(shí)間的變化如圖1 所示。由圖可見，隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜中的總酚含量呈上升趨勢(shì)，28d 時(shí)總酚含量為5.4mg/g。大蒜中多酚類物質(zhì)的主要成分為沒食子酸類化合物，在受熱過程中，大分子化合物發(fā)生分解，生成小分子物質(zhì)，釋放出更多含有酚羥基的化合物，因而使其相對(duì)含量得到提高［19］。

表1 清除DPPH 自由基實(shí)驗(yàn)加樣程序Table 1 Procedure for experiment of scavenging of DPPH·

圖1 美拉德反應(yīng)期間大蒜中總酚含量的變化Fig.1 Changes of total polyphenols in garlic during Maillard reaction

2.2 5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量的變化

HMF 是美拉德反應(yīng)重要的中間產(chǎn)物之一，可以根據(jù)5-HMF 的積累程度來反映食品的褐變程度。美拉德反應(yīng)期間大蒜中5-HMF 含量隨時(shí)間的變化如圖2 所示。由圖可見，隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜中的5-HMF 含量不斷增加，28d 時(shí)5-HMF 的含量為2729.12μg/g。說明美拉德反應(yīng)還在進(jìn)行，沒有達(dá)到終點(diǎn)。

圖2 美拉德反應(yīng)期間大蒜中5-HMF 含量的變化Fig.2 Changes of 5-HMF in garlic during Maillard reaction

2.3 美拉德反應(yīng)對(duì)大蒜還原力的影響

美拉德反應(yīng)期間大蒜還原能力隨時(shí)間的變化如圖3 所示。由圖可見，隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜的還原能力不斷增加，14d 后增加速度有所減緩，28d時(shí)，大蒜的還原力是美拉德反應(yīng)前的10 倍。前述研究表明，大蒜美拉德反應(yīng)期間酚類物質(zhì)含量增加，而酚類物質(zhì)是抗氧化性很強(qiáng)的物質(zhì)。此外，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物也具有很強(qiáng)的抗氧化能力，這些物質(zhì)的含量也是增加的。因此認(rèn)為酚類物質(zhì)和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是導(dǎo)致黑蒜具有比新鮮大蒜更高抗氧化能力的原因之一。

2.4 美拉德反應(yīng)對(duì)大蒜在脂質(zhì)體中抗氧化能力的影響

圖3 美拉德反應(yīng)期間大蒜還原能力的變化Fig.3 Changes in reducing power of garlic during Maillard reaction

美拉德反應(yīng)期間大蒜在卵磷脂質(zhì)體中抗氧化活性隨時(shí)間的變化如圖4 所示。由圖可見，隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜在卵磷脂脂質(zhì)體中的抗氧化能力呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。美拉德反應(yīng)28d 后，大蒜在卵磷脂脂質(zhì)體中的抗氧化能力是起初大蒜的3 倍。大蒜在卵磷脂質(zhì)體中的抗氧化能力呈上升趨勢(shì)是由于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中含有2-呋喃，及含N，S 雜環(huán)化合物(呋喃，吡啶，噻吩等)抗氧化物質(zhì)存在［20］。且隨著反應(yīng)的進(jìn)行反應(yīng)的產(chǎn)物會(huì)積累，此外酚類物質(zhì)的增加也是其抗氧化能力增加的原因之一，從而在卵磷脂質(zhì)體中的抗氧化能力呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。

圖4 美拉德反應(yīng)對(duì)大蒜在脂質(zhì)體中抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of Maillard reaction on antioxidant activity of garlic in liposome

2.5 大蒜清除羥基自由基的能力的變化

美拉德反應(yīng)期間大蒜清除羥基自由基能力隨時(shí)間的變化如圖5 所示。由圖可見，隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜清除羥基自由基的能力不斷增加。美拉德反應(yīng)28d 后，黑蒜清除羥基自由基的能力是普通大蒜的7 倍。羥基自由基的清除率是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)之一。清除率越大，表明抗氧化能力越強(qiáng)。大蒜清除羥基自由基的能力的變化與大蒜中總酚含量的變化趨勢(shì)是一致的。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜中的酚類物質(zhì)的增加且酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，從而清除羥基自由基的能力得到提高，另外，有報(bào)道認(rèn)為，清除羥自由基的能力增強(qiáng)與大蒜中的含硒蛋白、含硒多糖等物質(zhì)的增加也有一定的關(guān)系［21］。

2.6 大蒜清除超氧陰離子自由基能力的變化

圖5 美拉德反應(yīng)期間大蒜清除羥基自由基的能力Fig.5 Scavenging activity of garlic against ·OH during Maillard reaction

美拉德反應(yīng)期間大蒜清除超氧陰離子自由基能力隨時(shí)間的變化如圖6 所示。由圖可見，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜清除超氧陰離子自由基的能力呈增強(qiáng)的趨勢(shì)。美拉德反應(yīng)28d 后，黑蒜清除超氧陰離子自由基的能力是普通大蒜的10 倍。超氧自由基的清除率也是反映物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)之一。清除率越大，表明抗氧化能力越強(qiáng)。酚類物質(zhì)的增加是大蒜清除率增加的主要原因之一，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中具有抗氧化能力的物質(zhì)也有助于增強(qiáng)其清除率。另外，含硒蛋白、含硒多糖等物質(zhì)的增加也是原因之一。

圖6 美拉德反應(yīng)期間大蒜清除超氧陰離子自由基的能力Fig.6 Scavenging activity of garlic against O 2- · during Maillard reaction

2.7 大蒜的清除DPPH 自由基能力的變化

美拉德反應(yīng)期間大蒜的DPPH 自由基IC50值隨時(shí)間的變化如圖7 所示。由圖可見，隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行，大蒜清除DPPH 自由基IC50呈下降的趨勢(shì)。美拉德反應(yīng)28d 后，黑蒜清除DPPH 自由基的能力是普通大蒜的50 倍。DPPH 自由基IC50值是反映物質(zhì)抗氧化性能的指標(biāo)之一，IC50值越大，表明物質(zhì)的抗氧化性能越強(qiáng)。即隨著美拉德反應(yīng)時(shí)間的增加，大蒜的清除DPPH 自由基的能力越來越強(qiáng)。大蒜清除DPPH 自由基IC50呈下降的趨勢(shì)可能是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行大蒜中的酚類物質(zhì)、含硒蛋白、含硒多糖及美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等具有抗氧化活性物質(zhì)的增加。

圖7 美拉德反應(yīng)期間大蒜清除DPPH·的能力Fig.7 Scavenging activity of garlic against DPPH· during Maillard reaction

3 結(jié)論

美拉德反應(yīng)提高了大蒜的抗氧化能力，較白蒜都有了很大的提高。黑蒜的還原能力、在卵磷脂脂質(zhì)體中的抗氧化能力、羥基自由基的清除率、超氧陰離子自由基的清除率、及DPPH·的IC50值依次是普通大蒜的10、3、7、10、50 倍。黑蒜的抗氧化能力的增加在一定程度上與其含有的總酚和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的增加有關(guān)。

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