李艷暉 胡明明 沈銀武 劉永定 李敦海 李根保

(1.中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

超微浮游植物(Picophytoplankton, <3 μm)廣泛分布于各種類型和不同營養(yǎng)水平的湖泊中, 是水體的重要初級生產(chǎn)者[1,2], 包括超微藍(lán)藻(Picocyanobacteria)和超微真核藻(Eukaryotic picoalgae)。

一般來說, 典型的真核超微浮游生物的特征為：細(xì)胞球狀, 形態(tài)簡單, 以似親孢子或二分裂營無性生殖[3]。由于其細(xì)胞較小, 形態(tài)特征簡單, 使用普通光學(xué)顯微鏡甚至電子顯微鏡觀察也很難鑒定到綱水平[4], 因此常被描述為“Small coccoid 或Chlorellalike cells; little round green balls”(LRGT)或Nannochloris-like algae”[1,2], 導(dǎo)致了對這類藻進(jìn)行分類學(xué)描述和鑒定上的困難, 同時(shí)也人為降低了其在自然水體中的多樣性。

目前, 國外已報(bào)道的常見淡水真核超微藻種類主要有：Choricystis minor(Skuja) Fott[5—8]、Pseudodictyosphaerium jurisii(Hindák) Hindák[9]、Mychonastes homosphaera(Skuja) Kakina & Pun?ochá?ová[10,11]、Nannochloropsis limneticaKrienit, Hepperle, Stich &Weiler[4,12], 歐洲、北美、以色列等都有超微浮游植物分離、形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育方面的報(bào)道。我國尚未有關(guān)于淡水超微真核浮游植物的分布和多樣性方面的研究, 最新的藻類分類學(xué)資料《中國淡水藻類—系統(tǒng)、分類及生態(tài)》[13]中也沒有關(guān)于超微真核藻屬和種的描述。作者于2006年自滇池分離獲得 2株單種真核超微藻, 對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征觀察, 同時(shí)結(jié)合 18S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定其分類學(xué)地位, 填補(bǔ)我國淡水真核超微浮游植物分類學(xué)研究方面的空白。

1 材料與方法

1.1 藻株的分離與培養(yǎng)

取一定體積新鮮采集的水樣預(yù)過 Whatman GF/C玻璃纖維濾膜或Whatman 2.0 μm孔徑的聚碳酸酯膜, 取過濾水樣(或原水樣)劃平板或鋪平板接種于含 1%瓊脂的 BG11[14]或 BBM[15]固體培養(yǎng)基,用封口膜封好后將其倒置于光照培養(yǎng)箱內(nèi), 于20—30 μmol photons/(m2?s)、光暗周期 12h∶12h、溫度(25±1)℃條件下培養(yǎng), 待平板上長出可見藻落,挑取單藻落進(jìn)行鏡檢, 進(jìn)一步分離純化目的藻落,挑單藻落至BG11液體培養(yǎng)基, 于相同條件下培養(yǎng)。獲得藻株 DC-10和 DC-11 (分別于 2006年 7月和2006年10月分離自滇池水樣)。

1.2 形態(tài)學(xué)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

取培養(yǎng)至指數(shù)生長階段的藻細(xì)胞進(jìn)行光鏡及電鏡的樣品制備。分別用生物顯微鏡(Nikon ECLIPSE E600)、掃描電鏡(荷蘭FEI公司的Quanta 200)和透射電鏡(日本JEOL公司的JEM-1230)觀察。

1.3 藻細(xì)胞基因組DNA提取

方法參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(第四版)[16]。取適量體積指數(shù)生長期的藻液, 于 20℃,12000 r/min離心5min收集藻細(xì)胞并用無菌水洗滌3次, 加 567 μL的 TE緩沖液[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 20 mmol/L Na2EDTA]反復(fù)吹打使藻細(xì)胞重懸浮, 加 30 μL 10%的 SDS和 3 μL 20 mg/mL的蛋白酶K, 混勻, 37℃溫育1h, 期間不斷輕輕搖動; 加100 μL 5 mol/L的 NaCl, 充分混勻后加入 80 μL 10%的 CTAB/NaCl溶液, 混勻, 于 65℃溫育 30min; 加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1), 混勻, 于20℃, 10000 r/min離心10min, 小心吸取上清至新管中,加等體積氯仿/異戊醇(24/1), 混勻, 20℃, 10000 r/min離心 10min, 重復(fù) 1次; 轉(zhuǎn)移上清至新管中, 加 0.6倍體積的冰冷異丙醇沉淀DNA, 于4℃, 12000 r/min,10min離心收集DNA沉淀; 70%乙醇清洗2次后加50—100 μL 無菌水溶解 DNA, –20℃保存。

1.4 藻株18S rRNA基因序列分析18S rRNA基因擴(kuò)增

使用真核生物通用18S rRNA基因引物對 18F(5′-ACCTGGTTGATCCTGCCAG-3′)和 18R (5′-TGA TCCTTCT/CGCAGGTTCAC-3′) (Moon-van der Staay,2001)[17]擴(kuò)增藻株18S rRNA基因片段, 引物由上海英駿合成。PCR反應(yīng)體系為 20 μL, 包括： 10×PCR緩沖液[200 mmol/L (NH4)2SO4, 750 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 0.1% TWEEN 20], 1.5 mmol/L MgCl2,dNTP 200 μmol/L, 引物各 0.15 μmol/L, 1 μL 模板DNA, 0.2 UTaqDNA聚合酶(Fermentas), 加水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件為： 94℃預(yù)變性5min; 94℃ 60s,58℃ 60s, 72℃, 90s, 循環(huán)29次; 72℃延伸 10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 擴(kuò)增片段大小在1800 bp左右。

PCR產(chǎn)物的回收、純化與克隆 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物使用 OMEGA (USA)試劑盒回收純化, 連接至pMD 18-T vector (Takara, Japan), 轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH 5α感受態(tài)細(xì)胞, 使用引物對18F/18R進(jìn)行陽性克隆檢驗(yàn), 對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序, 由上海Invitrogen生命技術(shù)有限公司完成測序。

藻株系統(tǒng)發(fā)育分析 使用軟件 Clustal X(1.83)進(jìn)行多序列比對; MEGA 4.0采用鄰接法(NJ)和最大簡約法(MP)構(gòu)建系統(tǒng)樹, 自展率(Bootstrap)進(jìn)行1000次重復(fù), 獲得一致系統(tǒng)樹。用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的藻株及其GenBank信息(表1)。藻株DC-10和DC-11在GenBank中的登錄號分別為： JF834168和JF834169。

表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的藻株及其GenBank信息Tab.1 Strains used for phylogenetic tree construction and their GenBank information

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)特征分析

藻株 DC-10(圖 1a)和 DC-11均為單細(xì)胞, 細(xì)胞球形, 直徑 1.5—4 μm, 在光鏡下觀察細(xì)胞壁平滑,多見母細(xì)胞包被2個(gè)似親孢子進(jìn)行繁殖。

2.2 藻株DC-10的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

在掃描電鏡下觀察藻株 DC-10, 細(xì)胞球形, 不同于普通光學(xué)顯微鏡下觀察到的平滑細(xì)胞壁, 細(xì)胞壁表面具有不規(guī)則的肋網(wǎng)(圖1b)。

藻株 DC-10的超薄切片觀察結(jié)果(圖 1c-f)： 細(xì)胞壁2層, 外層寬20—25 nm, 為三層結(jié)構(gòu), 表現(xiàn)為暗–明–暗三層。每個(gè)細(xì)胞具備一套簡單的細(xì)胞器,主要包括： 1個(gè)細(xì)胞核, 1個(gè)線粒體和1個(gè)葉綠體。葉綠體周生, 杯狀, 占據(jù)細(xì)胞大部分體積, 不具蛋白核; 類囊體一般2—6層平行堆疊, 淀粉粒散布在其中, 但數(shù)量不多且并沒有在每個(gè)細(xì)胞中都觀察到。細(xì)胞核常位于葉綠體凹面對面, 線粒體則常位于細(xì)胞核和葉綠體之間, 脊數(shù)目較少, 三者占據(jù)了細(xì)胞的絕大部分體積, 在細(xì)胞質(zhì)中分布著數(shù)量眾多的核糖體(圖 1c-e)。

DC-10營似親孢子的無性繁殖方式, 如圖1c顯示的是由母細(xì)胞壁包被2個(gè)大小相同、具相同細(xì)胞器的似親孢子。似親孢子母細(xì)胞的外層細(xì)胞壁具典型的TL–層(Trilaminar Layer)結(jié)構(gòu), 2個(gè)暗層之間為透明電子層。

2.3 藻株DC-10、DC-11的18S rRNA基因序列分析

圖1 藻株DC-10顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Micrographs of green alga strain DC1-10

圖2 采用鄰接法(NJ)基于部分18S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree (neigh bor-joining) inferred from partial 18S rRNA gene sequences

圖3 采用最大簡約法(MP)基于部分18S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree (Maximum parsimony) inferred from partial 18S rRNA gene sequences

使用真核生物通用引物對 18F/18R擴(kuò)增藻株DC-10和 DC-11的 18S rRNA基因片段長度約為1800 bp, 同Mychonastes homosphaera(X73996和AB025423)相似性為99%, 在構(gòu)建的18S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2、圖3)中, DC-10和 DC-11同MychonasteshomosphaeraCCAP211/8E(X73996)、M.Homosphaera(AB025423)、M.homosphaeraCCAP 205 等Mychonastes(Simpson & van Valkenburg)屬的其他藻株以 85%的 bootstrap值組成麥可群, 為單起源,同Pseudodictyosphaerium jurisii以100%的bootstrap值分成 2個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化枝, 均屬于綠藻綱(Chlorophyceae), 同小球藻屬(ChlorellaBeijerinck)、Choricystis(Skuja) Fott等淡水中常見的真核超微藻屬種類所在的特波藻綱(Trebouxiophyceae)進(jìn)化枝相鄰。

2.4 麥可屬(Mychonastes Simpson et Van Valkenburg)

該屬特征同小球藻屬類似, 但不具蛋白核。細(xì)胞球形、卵形或橢圓形, 細(xì)胞壁厚, 2層, 外層細(xì)胞壁表面具肋網(wǎng); 單生或多個(gè)細(xì)胞聚集成群; 葉綠體1—4個(gè), 周生, 盤狀或杯狀, 常有淀粉粒; 通過似親孢子生殖; 不具動孢子; 細(xì)胞核1個(gè), 營養(yǎng)細(xì)胞中其大小有差異; 線粒體1個(gè)[10,22]。

藻株DC-10的細(xì)胞大小、形狀、葉綠體形態(tài)、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及似親孢子繁殖方式同麥可屬M(fèi).homosphaera基本相同[10]。在構(gòu)建的18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹中, DC-10和DC-11位于麥可屬群進(jìn)化枝上, 屬于綠藻綱。但由于選取的18S rRNA基因序列保守性高, 突變頻率低, 在構(gòu)建的進(jìn)化樹中不能進(jìn)一步確定其種水平。因此我們將DC-10和DC-11歸為麥可屬種類, 為我國首次報(bào)道的淡水超微真核藻。

3 討論

麥可屬由Simpson和Van Valkenburg于1978年首次描述, 其模式種為M.ruminatesSimpson & Van Valkenburg, 分離自美國馬里蘭州切薩皮克灣。隨后原先為小球藻屬的C.homosphaeraSkuja和C.zofingiensisD?nz被劃分至麥可屬, 分別重新命名為M.homosphaera和M.zofingiensis(D?nz) Kalina &Pun?ochá?ová[10,11]。M.homosphaera同M.ruminates形態(tài)相似, 只是生境不同,M.homosphaera分離自淡水, 而M.ruminates分離自半咸水。M.zofingiensis的細(xì)胞大小、葉綠體形狀和似親孢子數(shù)目不同于M.homosphaera, 細(xì)胞大小約 2倍于后者, 葉綠體幾個(gè)或多數(shù), 形成的似親孢子數(shù)目可達(dá)64個(gè)[10]。

同M.homosphaera不同之處在于, 在DC-10中我們觀察到的似親孢子的數(shù)目多為 2個(gè), 偶見母細(xì)胞包被 4個(gè)似親孢子, 這可能與使用的培養(yǎng)基不同或是處于不同的生長階段有關(guān)。另外, 同分離自以色列Kinneret湖的藻株相比, DC-10細(xì)胞壁上的肋網(wǎng)要密集一些。

麥可屬呈世界性分布, 生境廣泛, 包括溪流和大型靜止水體[11], 在肯尼亞Baringo湖和Victoria湖,瑞典Erken湖, 德國Stechlin湖, 印度Gandhi湖[11],以色列Kinneret湖[10], 瑞士Hagel湖、Lucerne湖和Alpnach湖[8], 美國北達(dá)科他州 Arrowwood國家野生動植物保護(hù)區(qū)內(nèi)淺水湖[18]都有分布。

分子系統(tǒng)學(xué)研究表明綠藻門似親孢子類球狀綠藻具有很多分類單元, Friedl基于18S rDNA序列分析, 將這類藻歸為 2個(gè)不同的綱, 分別是特波藻綱(Trebouxiophyceae)和綠藻綱(Chlorophyceae)[19]。根據(jù)Huss,et al.基于生物化學(xué)、生理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)研究的結(jié)果, 小球藻類群(Chlorellataxa)分屬于特波藻綱和綠藻綱, 其中M.homosphaera屬于綠藻綱。小球藻(C.vulgarisBeijerinck)、凱氏小球藻(C.kessleriFott & Nováková)、C.lobophoraAndreyeva和C.sorokinianaShih.& Krauss 4種屬于小球藻屬(ChlorellaBeijerinck), 屬特波藻綱, 其特征是葡萄糖胺為細(xì)胞壁主要成分, 具淀粉鞘且被 2層類囊體嵌入的蛋白核[9,20]。小球藻為小球藻屬的模式種, 其細(xì)胞壁薄, 不含孢粉類物質(zhì), 外層細(xì)胞壁不具暗–明–暗三層結(jié)構(gòu)[7]?！吨袊孱悺到y(tǒng)、分類及生態(tài)》[13]中小球藻屬有 3個(gè)種, 分別為小球藻, 橢圓小球藻(C.ellipsoideaGerneck)和蛋白核小球藻(C.pyrenoidosaChick), 《中國淡水藻志(第八卷)—綠藻門, 綠球藻目》[21]中小球藻屬包括 5種,除小球藻和橢圓小球藻外, 還有凱氏小球藻、喜糖小球藻(C.sacharophila(Krueger) Migula)和埃氏小球藻(C.emersoniiShihira & Krauss)。在Huss,et al.構(gòu)建的小球藻類 18S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹中, 喜糖小球藻、橢圓小球藻、C.luleoviridisChodat和C.mirabilisAndreyeva各以很高的bootstrap值(>88%)聚在一起, 說明它們之間親緣關(guān)系很近, 同小球藻屬均屬于特波藻綱[20]?？赏ㄟ^觀察藻細(xì)胞大小和是否含蛋白核來區(qū)分小球藻屬和麥可屬種類, 小球藻屬的4種藻細(xì)胞均不小于3 μm, 不屬于超微浮游植物范疇, 具蛋白核, 而麥可屬不具蛋白核。

另外?；煜男⌒颓驙铑愒暹€有Nannochloris(Naumann), 根據(jù) Naumann對Nannochloris屬模式種N.bacillaris(Naumann)的原始描述, 它通過二分裂方式繁殖, 屬于絲藻目(Ulotrichales)[7], 而麥可屬則以似親孢子方式繁殖。

偽網(wǎng)球藻屬(PseudodictyosphaeriumHindák)同麥可屬均隸屬于綠藻綱, 該屬的基本特征為： 單細(xì)胞或群體, 細(xì)胞直徑 2—10 μm, 葉綠體周生, 杯狀或帶狀, 不具蛋白核, 具一套簡單的細(xì)胞器, 其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)同麥可屬類似。分布于河流、湖泊和小型水體如池塘中, 德國Stechlin湖[9]和美國明尼蘇達(dá)州 Itasca湖[3]都有其分離報(bào)道。其中,P.jurisii(Hindák) Hindák 最初被描述為Dactylosphaerium jurisiiHindák, 后根據(jù)其不具蛋白核和動孢子將其劃分至偽網(wǎng)球藻屬(Pseudodictyosphaerium), 是一種常見的超微綠藻, 但細(xì)胞通常以群體形式存在, 由殘存的母細(xì)胞壁連接在一起, 使用墨汁負(fù)染色法很容易觀察到細(xì)胞包被在透明的無特殊結(jié)構(gòu)的膠被中,但是在野外或是室內(nèi)培養(yǎng)條件下, 群體很容易完全解聚[9,11], 因此增加了鑒定小型、球形或橢圓形類綠藻的困難。

球狀類超微綠藻由于其細(xì)胞小, 形態(tài)學(xué)特征相同而很難對其進(jìn)行正確分類, 應(yīng)結(jié)合電鏡和分子生物學(xué)方法方能更準(zhǔn)確地確定其分類學(xué)地位。我國有關(guān)淡水超微真核藻的分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)、生理生態(tài)學(xué)、多樣性及分子系統(tǒng)關(guān)系研究起步較國外晚, 因此有待于進(jìn)一步擴(kuò)大研究調(diào)查范圍, 分離培養(yǎng)獲得更多的超微浮游植物材料, 以完善我國的淡水超微浮游植物的分類學(xué)資料。

致謝：

衷心感謝魏印心先生、胡鴻鈞先生及劉其芳老師給予本文的指導(dǎo)和幫助。感謝云南大理洱海湖泊研究中心的衛(wèi)志宏、孟良和大理州環(huán)境監(jiān)測站工作人員在洱海樣品采集過程中的幫助和支持。

[1] Callieri C, Stockner J G.Freshwater autotrophic picoplankton： a review [J].Journal of Limnology, 2002, 61(1)： 1—14

[2] Stockner J G, Antia N J.Algal picoplankton from marine and freshwater ecosystems： a multidisciplinary perspective [J].Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 1986,43： 2472—2503

[3] Fawley M W, Fawley K P, Owen H A.Diversity and ecology of small coccoid green algae from Lake Itasca, Minnesota,USA, includingMeyeralla planktonica, gen.etsp.nov.[J].Phycologia, 2005, 44(1)： 35—48

[4] Krienitz L, Hepperle D, Stich H B,et al.Nannochloropsis limnetica(Eustigmatophyceae), a new species of picoplankton from freshwater [J].Phycologia, 2000, 39(3)： 219—227

[5] Krienitz L, Huss V A R, Hümmer C.PicoplanktonicChoricystisspecies (Chlorococcales, Chlorophyta) and problems surrounding the morphologically similar ‘Nannochloris-like algae’ [J].Phycologia, 1996, 35(4)： 332—341

[6] Belykh O I, Semenova E A, Kuznedelov K D,et al.A eukaryotic alga from picoplankton of Lake Baikal： morphology,ultrastructure and rDNA sequence data [J].Hydrobiologia,2000, 435： 83—90

[7] Hepperle D, Krienitz L.Systematics and ecology of Chlorophyte picoplankton in German inland waters along a nutrient gradient [J].International Review of Hydrobiology, 2001,86(3)： 269—284

[8] Hepperle D, Schlegel I.Molecular diversity of eukaryotic picoalgae from three lakes in Switzerland [J].International Review of Hydrobiology, 2002, 87(1)： 1—10

[9] Krienitz L, Takeda H, Hepperle D.Ultrastructure, cell wall composition, and phylogenetic position ofPseudodictyosphaerium jurisii(Chlorococcales, Chlorophyta) including a comparison with other picoplanktonic green algae [J].Phycologia, 1999, 38(2)： 100—107

[10] Hanagata N, Malinsky-Rushansky N, Dubinsky Z.Eukaryotic picoplankton,Mychonastes homosphaera(Chlorophyceae, Chlorophyta) in Lake Kinneret, Israel [J].Phycological Research, 1999, 47： 263—269

[11] Krienitz K, Bock C, Dadheech P K,et al.Taxonomic reassessment of the genusMychonastes(Chlorophyceae,Chlorophyta) including the description of eight new species[J].Phycologia, 2011, 50(1)： 89—106

[12] Fietz S, Bleiβ W, Hepperle D,et al.First record ofNannochloropsis limnetica(Eustigmatophyceae) in the autotrophic picoplankton from Lake Baikal [J].Journal of Phycology, 2005, 41： 780—790

[13] Hu H J, Wei Y X.The Freshwater Algae of China Systematics, Taxonomy and Ecology [M].Beijing： Science Press.2006, 209—903 [胡鴻鈞, 魏印心.中國淡水藻類—系統(tǒng)、分類及生態(tài).北京： 科學(xué)出版社.2006, 209—903]

[14] Rippka R, Deruelles J, Waterbury J B,et al.Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria [J].Journal of General Microbiology, 1979,111(1)： 1—61

[15] Nichols H W, Bold H C.Trichosarcina polymorphagen.etsp.nov.[J].Journal of Phycology, 1965, 1(1)： 34—38

[16] Ausubel F M, Brent R, Kingston R E,et al.Short Protocols in Molecular Biology [M] (4th ed.) John Wiley & Sons, Inc.,Publishers.2000, 55—56 [F.M.奧斯伯, R.布倫特, R.E.金斯頓.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第四版).北京： 科學(xué)出版社.2000, 55—56]

[17] Moon-van der Staay S Y, De Wachter R, Vaulot D.Oceanic 18S rDNA sequences from picoplankton reveal unsuspected eukaryotic diversity [J].Nature, 2001, 409： 607—610

[18] Phillips K A, Fawley M W.Diversity of coccoid algae in shallow lakes during winter [J].Phycologia, 2000, 39(6)：498—506

[19] Friedl T.Inferring taxonomic positions and testing genus level assignments in coccoid green lichen algae： a phylogenetic analysis of 18S ribosomal RNA sequences fromDictyochloropsis reticulataand from members of the genusMyrmecia(Chlorophyta, Trebouxiophyceae cl.nov.) [J].Journal of Phycology, 1995, 31： 632—639

[20] Huss V A R, Frank C, Hartmann E C,et al.Biochemical taxonomy and molecular phylogeny of the genusChlorellasensu lato (Chlorophyta) [J].Journal of Phycology, 1999, 35：587—598

[21] Bi L J, Hu Z Y.Flora Algarum Sinicarum Aquae Dulcis.Tomus VIII.Chlorophyta.Chlorococcales [M].Beijing： Science Press.2005, 30—32 [畢列爵, 胡征宇.中國淡水藻志第八卷 綠藻門 綠球藻目.北京： 科學(xué)出版社.2005, 30—32]

[22] Simpson P D, Van Valkenburg S D.The ultrastructure ofMychonastes ruminatesgen.etsp.nov., a new member of the Chlorophyceae isolated from brackish water [J].European Journal of Phycology, 1978, 13： 117—130