張俊玲 施志儀 程 琦 陳曉武 王曉竹

(上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306)

胰島素樣生長因子-I 受體(Insulin-like growth factor-I receptor, IGF-IR)是一種跨膜的酪氨酸激酶受體蛋白, 是IGF-I生物功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。當(dāng)配體IGF-I與其結(jié)合時(shí)激活酪氨酸激酶活性, 從而引起大多數(shù)細(xì)胞的促有絲分裂和抑制凋亡效應(yīng), 在細(xì)胞的正常生長和分化中起至關(guān)重要的作用。在生物體內(nèi),IGF-IR基因的表達(dá)受到多層次的調(diào)控, 其中以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控為主。人IGF-IR基因的啟動子是一個(gè)不含TATA框和CAAT框、高GC含量、“initiator” 型的啟動子。P53、SP1、KLF16、c-Jun、ER-α和WT1等均是人IGF-IR基因5′調(diào)控區(qū)已鑒定的轉(zhuǎn)錄因子[1—4]。但是在低等生物包括魚類中,IGF-IR基因的5′調(diào)控區(qū)序列及啟動子特征很少有報(bào)道。

越來越多的研究表明, IGF-I通過與其受體IGF-IR結(jié)合在魚類生長、發(fā)育、代謝、繁殖、滲透壓調(diào)節(jié)及免疫等眾多生理過程中發(fā)揮重要作用[5—7]。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一, 也是變態(tài)發(fā)育、繁殖及內(nèi)分泌生理研究較為集中的魚類物種。我們先前的研究分析了IGF-I及IGF-IR在牙鲆發(fā)育生長過程中的時(shí)空表達(dá)及其與甲狀腺激素(Thyroid hormone, TH)的作用關(guān)系[8,9], 因而在此基礎(chǔ)上, 本研究克隆了牙鲆IGF-IR基因的 5′調(diào)控區(qū)序列, 并預(yù)測了其潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 初步檢測了該序列的啟動子活性, 為深入研究魚類IGF-IR基因的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控及探討TH對其基因表達(dá)的調(diào)節(jié)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

牙鲆成魚購自上海市銅川路水產(chǎn)品市場, 解剖取其肌肉組織, 無菌水沖洗干凈后立即用于基因組 DNA 的提取。DNA 提取試劑盒購自 Beyotime 公司, 膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提取試劑盒、Lipofect Transfection Reagent、感受態(tài)細(xì)胞 DH5α、X-gal、IPTG、DNA Marker購自Tiangen 公司; pAcGFP1-1 載體購自 Clontech 公司; Genome Walking Kit、LATaq酶、限制性內(nèi)切酶SalI、EcoR I、pMD18-T 載體、T4 DNA Ligase購自Takara 公司。LB培養(yǎng)基、抗生素購自上海生工生物工程技術(shù)公司, DMEM 培養(yǎng)基購自 GIBCO 公司, 0.25%胰酶-EDTA購自 Invitrogen 公司, 小牛血清購自杭州四季青公司, 293細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

基因組DNA 的提取 取約25 mg 的牙鲆肌肉組織, 剪切成盡可能小的碎片, 然后按照基因組 DNA小量抽提試劑盒說明書操作步驟提取基因組 DNA, 經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性, 并計(jì)算其濃度和純度。

5′調(diào)控區(qū)的擴(kuò)增 根據(jù)已知的牙鲆IGF-IRcDNA(GI： 18150107)5′UTR 序列設(shè)計(jì)三條特異性引物, GSP1：5′-CCTGGTGGTAACAACTGAGAATA-3′, GSP2： 5′-AGC AGCCTCCACAGAACAT-3′, GSP3： 5′-AATGGCGAGGA AGGGTGG-3′。接頭引物 AP1、AP2、AP3、AP4 由 Genome Walking Kit 提供。

采用基于熱不對稱PCR的染色體步移技術(shù)擴(kuò)增5′調(diào)控區(qū)序列。取適量基因組 DNA作為模板, 以接頭引物AP(四種中的任意一種, 本研究經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)選用的是 AP1)作為上游引物, 分別以IGF-IRGSP1、GSP2 和GSP3 作為下游引物, 進(jìn)行三輪 PCR, 具體操作按照 Takara 公司的Genome Walking Kit說明書進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳, 回收目的片段經(jīng)過純化、連接pMD18-T載體、轉(zhuǎn)化 DH5α。藍(lán)白斑篩選, 挑取陽性克隆, 經(jīng)過菌落 PCR驗(yàn)證確實(shí)有大小正確的插入片段后進(jìn)行測序, 測序由上海生工生物工程技術(shù)公司完成。

5′調(diào)控區(qū)的生物信息學(xué)分析 利用 3種基因啟動子在線分析軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/promoter/)、(http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 和 (http：//bimas.dcrt.nih.gov/mol bio/proscan/) 預(yù)測啟動子區(qū)域結(jié)構(gòu)特征, 利用 TFSEARCH程序(http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html) 對轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 TRANSFAC(http：//transfac.gbf.de/TRANSFAC/)進(jìn)行搜索, 尋找可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

重組報(bào)告基因表達(dá)載體pAcGFP1-IR的構(gòu)建 根據(jù) pAcGFP1-1 載體多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物, 通過 PCR 擴(kuò)增在牙鲆IGF-IR基因 5′調(diào)控序列兩端加上酶切位點(diǎn)。IR913EcoR I ： 5′-GCGGAATTC ACAGACAGAGGGAC-3′,IR913Sal I： 5′-CGCGTCGAC AATGGCGAGGAAG-3′, 其中下劃線為引物中引入的酶切位點(diǎn)SalI和EcoR I, 斜體為保護(hù)堿基。

擴(kuò)增產(chǎn)物首先經(jīng)過純化、連接 pMD18-T 載體、轉(zhuǎn)化DH5α, 藍(lán)白斑篩選、挑取陽性克隆、抽提質(zhì)粒DNA。采用SalI、EcoR I 進(jìn)行37℃ 雙酶切鑒定, 確定是否包含IGF-IR基因 5′ 調(diào)控區(qū)片段及載體序列(大小分別為 913 bp 和 2.6 kb)。將鑒定正確的 PCR產(chǎn)物、啟動子缺失的pAcGFP1-1 載體分別進(jìn)行雙酶切, 37℃過夜, 酶切產(chǎn)物回收后經(jīng)T4 DNA Ligase 16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α, 37℃平板培養(yǎng), 挑取陽性克隆, 雙酶切驗(yàn)證重組載體。然后送上海生工生物工程技術(shù)公司測序驗(yàn)證。

pAcGFP1-IR的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 將經(jīng)鑒定正確的pAcGFP1-IR 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 培養(yǎng)200 mL菌液, 使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取不含內(nèi)毒素的pAcGFP1-IR 重組質(zhì)粒, 抽提步驟按照 TIANGEN 公司的無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書進(jìn)行, 用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

293 細(xì)胞置于37℃, 5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天, 胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù), 取2×105細(xì)胞鋪板在0.5 mL含血清、不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中, 使其在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度為90%—95%。使用24孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn), 操作步驟按照 Tiangen 公司的 Lipofect Transfection Reagent說明書進(jìn)行。分別在轉(zhuǎn)染24h、48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆 IGF-IR基因5′調(diào)控區(qū)的克隆

以牙鲆基因組DNA 為模板, 分別以IGF-IR基因的GSP1、GSP2、GSP3和AP1 為引物, 經(jīng)過三輪 PCR擴(kuò)增得到一段 936 bp的IGF-IR5′ 調(diào)控區(qū)序列(圖 1)。

2.2 牙鲆 IGF-IR基因 5′調(diào)控區(qū)的序列分析

對克隆得到的牙鲆IGF-IR5′ 調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 該序列有潛在的啟動子區(qū)。如圖2所示, 將評分為1.00的潛在啟動子區(qū)起始子“A”規(guī)定為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) TSS, 它位于翻譯起始密碼子 ATG上游的?637位, 該啟動子既有典型的 TATA 框, 又含有“initiator”序列, 但無CCAAT框; 評分為0.98的潛在啟動子區(qū)位于規(guī)定TSS上游的?589位, 無TATA和CCAAT框。搜索TRANSFAC 數(shù)據(jù)庫, 找到93處最佳相互匹配的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 其中AP1、AP2、C/EBP、p300、E2F、多個(gè) Sp1及c-Myb、Brn2、Oct-1、ER、GR、PR、MyoD和SRY等是誘導(dǎo)牙鲆IGF-IR基因轉(zhuǎn)錄的潛在作用因子。

2.3 牙鲆IGF-IR 5′調(diào)控序列的啟動子活性檢測

采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法, 將構(gòu)建成功的pAcGFP1-IR轉(zhuǎn)染293細(xì)胞, 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),可見細(xì)胞狀態(tài)良好, 未見成片細(xì)胞脫落死亡。pAcGFP1-IR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 24h后, 在倒置熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光信號(圖3A), 48h后可觀察到綠色熒光信號增強(qiáng)(圖3B)。陽性對照采用轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒(圖3C),陰性對照為轉(zhuǎn)染啟動子缺失的 pAcGFP1-1載體, 無綠色熒光表達(dá)(圖3 D)。

圖1 牙鲆 IGF-IR 基因 5′ 調(diào)控區(qū)序列克隆Fig.1 5′ regulatory sequence cloning of IGF-IR gene from Japanese flounder by the technique of genome walking

3 討論

本研究采用了一種基于熱不對稱 PCR的染色體步移技術(shù)獲得牙鲆IGF-IR基因的5′調(diào)控區(qū)[10], 它可根據(jù)已知基因的 5′UTR序列設(shè)計(jì)三條同向且退火溫度較高的特異性引物即 GSP1、GSP2和GSP3, 與試劑盒提供的四種經(jīng)過獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低的兼并引物即AP1、AP2、AP3和AP4進(jìn)行熱不對稱PCR反應(yīng), 通過三次巢式PCR即可獲取已知序列的側(cè)翼序列, 與以往傳統(tǒng)方法相比, 具有高效、簡便、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。為此, 本研究成功獲得了一段936 bp大小的牙鲆IGF-IR基因5′調(diào)控區(qū)序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), 獲得的牙鲆IGF-IR基因5′調(diào)控區(qū)有2處潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn), 其中位于翻譯起始密碼子ATG上游的?637位的區(qū)域評分較高, 且含有“initiator”序列, 無 CCAAT 框, 與人和小鼠IGF-IR基因的“initiator” 型啟動子較相似[11—13], 不同的是除“initiator” 序列外,該區(qū)域還含有傳統(tǒng)的 TATA框, 屬含有TATA框和Inr的啟動子, 這樣TBP本身能結(jié)合于啟動子的TATA框, 也可同TFDⅡ中的 TAF Ⅱ亞基一起結(jié)合。此外, 預(yù)測的第二處潛在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前后序列與哺乳動物差異較大。本研究通過與綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)載體重組, 脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 293細(xì)胞, 初步表明該序列具有啟動子的活性。

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn), 牙鲆IGF-IR基因5′調(diào)控區(qū)不僅含有E2F、C/EBP、p300、AP2等潛在的轉(zhuǎn)錄因子, 還有較多的Sp1可能結(jié)合位點(diǎn), 這與在人和小鼠中是相一致的[11—13]。轉(zhuǎn)錄因子 Sp1能和GC盒相結(jié)合, 在SC40啟動子中有多個(gè)GC盒,它們均能和Sp1相結(jié)合, 然而含有GC盒的不同的DNA順序與 Sp1的親和力卻各不相同。體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也表明Sp1能激活I(lǐng)GF-IR基因的表達(dá)[14]。重要的是, 本研究發(fā)現(xiàn)牙鲆IGF-IR基因5′調(diào)控區(qū)分布有ER、GR、PR、MyoD、Oct-1、c-Myb、Brn2、SRY等潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn), 這些轉(zhuǎn)錄因子大多也在人和小鼠IGF-IR基因 5′調(diào)控區(qū)存在, 提示IGF-IR基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件在哺乳動物和魚類中是相對保守的。其中ER、GR、PR和TR同屬配體依賴型的核受體轉(zhuǎn)錄因子家族, 識別的半位點(diǎn)序列類似。有研究發(fā)現(xiàn), 如果將ER和TR轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)染CV1細(xì)胞, 當(dāng)添加TH時(shí)會減弱雌激素響應(yīng)的靶基因轉(zhuǎn)錄,且這種抑制效應(yīng)具有配體依賴性, 使用不同亞型的TR(TRαA、TRαB、TRβ1 和 TRβ2)效應(yīng)也不同[15]。在大多數(shù)組織細(xì)胞中, ER、GR、PR和 TR以及 RXR、VDR等核受體轉(zhuǎn)錄因子是共表達(dá)的, 因而它們之間可以形成“異二聚體”激活特定基因轉(zhuǎn)錄; 當(dāng)某種激素或轉(zhuǎn)錄因子水平過高時(shí), 彼此間產(chǎn)生競爭性抑制如ER和TR似乎也是很有可能的。因此, 盡管在克隆的牙鲆IGF- IR基因5′調(diào)控序列范圍內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)潛在的 TR結(jié)合位點(diǎn)(不排除在更上游存在這一位點(diǎn)的可能), 但甲狀腺激素仍有可能通過上述核受體轉(zhuǎn)錄因子影響IGF-IR基因的表達(dá)。

圖2 牙鲆IGF-IR 基因5′調(diào)控區(qū)序列及潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)Fig.2 Sequences and potential transcript binding sites of 5′ regulatory region ofIGF-IR gene from Japanese flounder

圖3 pAcGFP1-IGF-IR在293 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression of pAcGFP1-IGF-IR in 293 cells

此外, MyoD 與 Myogenin、Myf5、MRF4 同屬bHLH(basic helix-loop-helix)家族, 是專一性的生肌調(diào)節(jié)因子, 在肌肉發(fā)生與分化中起重要作用。研究表明MyoD基因調(diào)控區(qū)具有TR作用元件, 是甲狀腺激素直接響應(yīng)的基因, TH可通過調(diào)節(jié)MyoD的表達(dá)而調(diào)控肌肉的形態(tài)發(fā)生[16,17]。Oct-1是調(diào)控真核細(xì)胞生長的重要因子, 一旦Oct-1表達(dá)降低將會引起細(xì)胞周期停滯, 細(xì)胞暫時(shí)退出細(xì)胞周期并開始形態(tài)分化[18]。Dowling,et al.[19]在小鼠中發(fā)現(xiàn)當(dāng)妊娠期內(nèi)源甲狀腺激素尚未分泌之前, T4處理能增加Oct-1 mRNA的表達(dá); 并且從胎兒到成體期, TH均能調(diào)節(jié)Oct-1的表達(dá)。c-Myb起初被鑒定為原癌基因, 在未成熟的造血細(xì)胞表達(dá)量很高, 當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分化時(shí)其表達(dá)明顯降低, 是一種調(diào)控細(xì)胞增殖的重要轉(zhuǎn)錄因子[16]。Brn2是調(diào)節(jié)表皮角質(zhì)細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子[20], 還可使皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞[21]。而SRY則為性別決定基因,它在牙鲆IGF-IR基因調(diào)控區(qū)的潛在出現(xiàn)提示了IGF-I可能與魚類性別分化有關(guān)。

綜上所述, 這些潛在轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步支持了牙鲆IGF-I及受體基因在細(xì)胞周期調(diào)控、促進(jìn)細(xì)胞分化與生長中發(fā)揮重要作用, 同時(shí)還暗示了甲狀腺激素很有可能通過調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)而影響 IGF-I/IGF-IR系統(tǒng)的生物學(xué)功能。

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