劉 洋 朱夢靈 徐 瑤 虞功亮 李仁輝

(中國科學院水生生物研究所, 武漢430072)

擬甲色球藻(Chroococcidiopsis)是 Geitler 在1933年建立的單細胞群體藍藻, 在現(xiàn)代四目藍藻分類系統(tǒng)中[1], 它屬于色球藻目、異球藻科(Xenococaceae)。擬甲色球藻在全球分布廣泛, 從南極的巖石縫隙到印度尼西亞的熱泉, 以及世界各地的炎熱沙漠或山洞中都曾發(fā)現(xiàn)過[2—6], 而且在熱帶的草原上發(fā)現(xiàn)它們存在于地衣共生系統(tǒng)中[7]。擬甲色球藻的一些種類能長期抗干旱和電離輻射[8], 為此美國國家航空航天局的一些科學家就希望通過研究使其成為火星的拓荒者。另外, 一些擬甲色球藻種類則生活在水體中, 包括淡水、海水、高鹽度水體[9]。目前,國際上對擬甲色球藻的關注多集中在對荒漠等極端環(huán)境下的研究, 水體中也是以溫泉為主的報道。我們最近在太湖進行藍藻水華的調查和研究時, 發(fā)現(xiàn)了擬甲色球藻存在于太湖水體中, 通過對野外水體樣品的分離培養(yǎng), 獲得了擬甲色球藻單種培養(yǎng)藻種。通過對野外樣品以及單種培養(yǎng)藻種的形態(tài)觀察和聚類分析, 確認為擬甲色球藻(Chroococcidiopsis)的藻種, 這是尚未在中國報道過的新記錄屬。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

采集地點為地處于江蘇省宜興大浦鎮(zhèn)附近的西太湖, 坐標為N31°06′8.70″E 120°0′5.90″, 用 25號篩絹制作的浮游生物網(wǎng)采集藻類樣品。

1.2 藻種分離

用毛細管分離法： 將滅菌后的巴斯德吸管制作成毛細管(Pasteur Micropipette), 在解剖鏡下挑取單個群體, 清洗6—8次后[10], 最后放入含有2 mL CT培養(yǎng)基[11]的24孔細胞培養(yǎng)板(無菌)中, 培養(yǎng)溫度為25, ℃白色燈光為光源, 光照強度為25 μE/(m2·s),光照周期為12h∶12h (L∶D)。本研究使用的藻株編號為 CHAB1690, 藻種保存于中國科學院水生生物研究所有害藻類學科組藻種庫。

1.3 形態(tài)觀察和測量

藻細胞形態(tài)的觀察使用Nikon eclipse 80i型光學顯微鏡, 外接數(shù)碼相機(DS-Ri1)與臺式計算機。數(shù)碼拍照和數(shù)據(jù)測量通過其附帶的圖像分析軟件NIS-Elements D 3.2實行。選取50個以上的藻體進行各項數(shù)據(jù)的測量統(tǒng)計。

1.4 16S rRNA基因序列測定和分子系統(tǒng)分析

對分離的藻株培養(yǎng)富集后, 進行DNA提取, 方法參考Lin,et al.[12]。用于擴增16S rDNA的引物為：27F1(5′-AGAGTTTTGATCCTGGCTCAG-3′)[13]和B23S (5′-CTTCGCCTCTGTGTGCCTAGGT-3′)[14],由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR反應體系為 50 μL, 包含 200 mmol/L dNTP; 1.5 mmol/L MgCl2;1×bufferPCR緩沖液; 10 pmol引物; 1 UTaqDNA聚合酶。PCR反應條件為： 94℃預變性5min; 94℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸2min, 35個循環(huán); 72℃延伸5min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 通過膠回收試劑盒回收(BioFlux), 克隆到載體pMD18-T上(Takara, Japan)。將克隆載體轉入感受態(tài)細胞E.coliDH5α中, 菌液送北京華大基因科技有限公司進行雙向測序, 測序后得到兩段序列用BioEdit軟件拼接。序列通過NCBI的BLAST進行比對, 并將獲得序列和從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的基因序列用Clustal X1.83軟件進行對位排列。運用分子進化遺傳分析軟件 MEGA5.0基于 Kimura two-parameter模型構建鄰接法關系樹(NJ tree), 步展值(Bootstrap value)設為1000, 空位或缺失位點均當作配對刪除(Pairwise deletion)處理, 以Gloeobacter violaceusPCC 7421 為外類群。

2 結果

2.1 擬甲色球藻屬Chroococcidiopsis形態(tài)特征

擬甲色球藻屬(Chroococcidiopsis)由 Geitler建立于 1933年, 現(xiàn)在的分類系統(tǒng)中隸屬于藍藻門(Cyanophyta)、藍藻綱(Cyanophyceae)、色球藻目(Chroococcales)、異球藻科 (Xenococcaceae), 以溫泉擬甲色球藻(Chroococcidiopsis thermalis)為模式種。本屬目前共報道過13個種[1]。

單細胞或形成規(guī)則或不規(guī)則的球狀群體。群體具有薄而堅實的無色膠被(圖 1B中箭頭所指, 子細胞逃逸后留下的膠被)。群體常常聚集成肉眼可見的片狀。群體直徑為31—57 μm, 平均直徑為40 μm。細胞球形、半球形或類多邊形, 直徑4—10 μm, 平均直徑為 6.5 μm, 細胞不規(guī)則分裂, 母細胞分裂出的子細胞通常大小形態(tài)各異(圖1C箭頭所指)。原生質體綠色, 無氣囊。同一群體中的細胞尺寸大小不一, 排列緊密(圖1)。

有些細胞之后會變成內生孢子(或者某個群體中的部分細胞), 不同種類, 其內生孢子數(shù)量不同。絕大部分擬甲色球藻的內生孢子無運動特征, 但偶有出現(xiàn), 且運行型內生孢子的出現(xiàn)取決于環(huán)境因子。分裂后的細胞或單細胞會從裂開的膠被中釋放出來, 群體膠被通常透明。

2.2 分子系統(tǒng)分析

利用上述引物擴增 16S rRNA 基因, 獲得了2127 bp的序列, GenBank號為 JX494785。但與GenBank藻株序列進行比對處理后, 截取了最大可使用的 1182 bp構建系統(tǒng)樹。 將測序結果和通過Blast比對得到的相似序列以及目前Genbank中已有的擬甲色球藻16S rRNA基因序列構建分子系統(tǒng)樹(圖2)。太湖的ChroococcidiopsisCHAB1690藻株同兩株歐洲的Chroococcidiopsis藻株(AJ344552和AJ344555)相似度很高(相似度均達到 99%), 從而聚在一起(圖2)。而目前Genbank收集的擬甲色球藻種類在分子系統(tǒng)樹上歸屬于兩個類群(I和II), 太湖的藻株則聚在了類群 I, 該類群藻株的最低相似度為88%。另有少數(shù)藻株聚在了較遠的另一個類群 II。兩個類群的最低相似度為86%。

圖1 顯微鏡下Chroococcidiopsis CHAB1690的形態(tài)Fig.1 Morphological image of Chroococcidiopsis CHAB1690

3 討論

單細胞群體藍藻異球藻科(Xenococcaceae)在以前五目藍藻分類系統(tǒng)(色球藻目、厚皮藻目、顫藻目、念珠藻目和真枝藻目)中歸屬于厚皮藻目, 但是最近的藍藻分類系統(tǒng)還是以四目系統(tǒng)為主流[1]。與擬甲色球藻屬同屬于異球藻科的還有另外 5個屬(Chroococcidium、Myxosarcina、Xenococcus、Chroococcopsis、Xenotholos), 該屬區(qū)別于其他藻屬的特征是群體具有薄而堅固且清晰的膠鞘, 并且群體內的細胞不會出現(xiàn)排成一列的假絲形態(tài)或階段[1]。中國擬甲色球藻雖然尚未得到詳細描述, 但在個別文獻中也有提及, 且在一些文獻中被譯為擬色球藻[15]。根據(jù)藻屬拉丁名的詞根含義,Chroococcopsis才是擬色球藻, 且已有資料可考[16]。從兩屬的形態(tài)特征比較來看, 擬甲色球藻屬群體內的細胞不會出現(xiàn)成列細胞的假絲形態(tài)或階段, 而在擬色球藻屬(Chroococcopsis)藻株的群體中則會呈現(xiàn)出成列細胞扇形分布的現(xiàn)象[1]。擬甲色球藻屬目前報道有13個種, 但詳細描述的僅有 2個種,其中溫泉擬甲色球藻(Chroococcidiopsis thermalis)為淡水種, 常在溫泉中發(fā)現(xiàn),Chroococcidiopsis fissurarum則生活在海水中。根據(jù)形態(tài)特征, 太湖的擬甲色球藻類似于溫泉擬甲色球藻, 但是此太湖藻種的16S rRNA基因序列同溫泉擬甲色球藻(Chroococcidiopsis thermalisPCC7203)的相似度僅為91%。而同本太湖藻種最為相似的兩歐洲藻種并沒有確定種名, 并且它們的形態(tài)特征也無法查閱。所以從生活習性和16S rRNA基因的序列來看, 此太湖的種類基本可以排除在Chroococcidiopsis thermalis和Chroococcidiopsis fissurarum之外, 但它是否為一新種, 還是其他的種類還需要大量的深入研究?？傊? 以形態(tài)特征為界定的擬甲色球藻屬并不是一個單系類群。分子系統(tǒng)學分析表明, 擬甲色球藻屬的類群 I和類群II中藻株的最低相似度僅為86%, 而類群I內部中藻株的最低相似度也不到 90%。根據(jù)屬內 16S rRNA序列相似度不低于 95%的原則[17,18], 這兩個類群中的藻株可能不屬于同一個屬, 所以目前的擬甲色球藻屬(Chroococcidiopsis)中可能包含了多個種。對擬甲色球藻屬分類學的整理, 需要對此屬的模式種類(Type species)和模式藻種(Type strain)的準確確定, 通過大量的多種特征的比較, 才能建立起一個自然的擬甲色球藻的分類系統(tǒng), 為異球藻科分類系統(tǒng)的梳理提供條件。我們期待中國境內更多擬甲色球藻屬的藻類的發(fā)現(xiàn), 為其分類學和其他生物學的研究提供更多的材料。

圖2 基于16S rRNA基因序列的NJ分子系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree (NJ) based on 16S rDNA sequences

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