周 薇，李軍華

(荊門市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 荊門 448000)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性非特異性的腸道炎癥性疾病，近年在我國的發(fā)病呈上升趨勢，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，可能與遺傳易感性、感染、免疫異常有關(guān)。腸道炎癥細(xì)胞持續(xù)作用在潰瘍性結(jié)腸炎癥損傷中發(fā)揮重要作用，炎癥細(xì)胞凋亡延遲參與了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過程［1，2］。p38蛋白激酶是絲裂原活化蛋白激酶超家族(MAPKs)的成員之一，可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞的增殖、分化和成熟及凋亡等過程［3］。本研究通過觀察潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸組織中p38 蛋白激酶活化與腸道淋巴細(xì)胞凋亡及腸道炎癥嚴(yán)重程度之間的關(guān)系，以明確p38 蛋白激酶在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)健康成年SD 大鼠30 只(武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量140±20g。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

2、4、6-三硝基苯磺酸(Sigma 公司產(chǎn)品);兔抗大鼠磷酸化的p38MAPK 多克隆抗體，p-ATF2、Bcl-2 和Bax 單抗(Santa Cruz 公司);SB203580(Calbiochem 公司);SP、DAB 試劑盒及MPO 試劑盒分別為武漢晶美公司及南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

參照文獻(xiàn)［4］復(fù)制大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。大鼠術(shù)前禁食24h，自由飲水。以5%(w/v)的2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)與無水乙醇以體積1 ∶1配成25mg/ml 的混合溶液。乙醚吸入麻醉大鼠后采用直徑約2.0mm 的軟橡膠管輕緩插入肛門約8cm，用2ml 注射器按50mg/kg (即0.2ml/100g)劑量將配制好的TNBS 灌入大鼠腸腔;灌腸完成后倒提鼠尾30 余秒，防止灌注液倒流。操作完成后讓動(dòng)物保持平躺自然清醒。30 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組、SB203580組共3組。正常對(duì)照組以等量生理鹽水溶液代替三硝基苯磺酸(TNBS)作對(duì)照。SB203580組于造模后分別以1mg/kg·d SB203580 腹腔注射，連續(xù)2周。

1.2.2 標(biāo)本處理

兩周后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，取結(jié)腸組織沿腸管縱軸剪開并用冰生理鹽水洗凈，進(jìn)行大體形態(tài)評(píng)分。一部分結(jié)腸組織以4.0%多聚甲醛固定，石蠟包埋連續(xù)切片。分別參照文獻(xiàn)［4］計(jì)算腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)及病理組織學(xué)評(píng)分(HS)。CMDI分四級(jí):0 級(jí)為無損傷;1 級(jí)為輕度充血、水腫，無糜爛或潰瘍;2 級(jí)為充血水腫，有糜爛或腸粘連;3 級(jí)為重度充血水腫，表面有壞死及潰瘍形成，潰瘍小于1cm;4 級(jí)為高度充血水腫，黏膜壞死及潰瘍形成，潰瘍大于1cm，或全壁腸壞死，中毒性巨結(jié)腸死亡。病理組織學(xué)評(píng)分按潰瘍、肉芽腫及纖維化有無及輕重分別計(jì)0、1、2分;病變深度按達(dá)到黏膜下層、肌層及漿膜層分別計(jì)1、2、3分，各項(xiàng)相加計(jì)總分。

1.2.3 免疫組化方法檢測腸組織p-ATF2、Bcl-2和Bax 表達(dá)

石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2孵育10min 后PBS 漂洗，置0.1M 枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行微波抗原修復(fù);室溫冷卻后PBS 沖洗3次，10%正常血清封閉，室溫孵育10min;傾去血清，勿洗，滴加1∶100 稀釋的p-p38，p-ATF2，Bcl-2 和Bax 抗體，4℃過夜。PBS 沖洗后滴加生物素化二抗，室溫孵育20min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的卵白素工作液，PBS 沖洗后，DAB 顯色液顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯中透明后中性樹脂封片。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(400 倍)，計(jì)算陽性細(xì)胞所占比例。

1.2.4 TUNEL 染色方法

石蠟切片脫蠟水化，20μg/ml 蛋白酶K 37℃作用15min，PBS 洗3次后以3% H2O2室溫孵育10min，PBS 洗3次，用50μl 含TdT、dUTP 的生物素標(biāo)記液37℃孵育1h，PBS 洗3次，滴加streptavidin HRP 工作液室溫孵育30min，漂洗后DAB 顯色。

1.2.5 生化方法檢測結(jié)腸組織MPO 含量

具體操作步驟按試劑盒提供的說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠結(jié)腸黏膜損傷情況及病理學(xué)評(píng)分

模型組可見腸黏膜充血水腫、糜爛、出血及潰瘍形成，光鏡下見腸上皮細(xì)胞脫落或壞死，黏膜層，黏膜下層見較多炎性細(xì)胞浸潤，可見隱窩膿腫，潰瘍形成。SB203580組結(jié)腸大體損傷情況及組織學(xué)表現(xiàn)明顯減輕，黏膜充血水腫減輕或消失，潰瘍愈合，CMDI 及HS 評(píng)分明顯低于模型組(P＜0.01)，見表1。

表1 各組大鼠結(jié)腸大體形態(tài)和組織學(xué)損傷評(píng)分及MPO 活性()

2.2 腸組織磷酸化p38 及p-ATF2、Bcl-2 和Bax表達(dá)

與正常組相比，模型組p-p38，p-ATF2 及Bcl-2 表達(dá)明顯上升(P＜0.01)，Bax 表達(dá)明顯下降;SB203580組中p-ATF2、Bcl-2 較模型組明顯降低(P＜0.01)，但p-p38 及Bax 表達(dá)與模型組無顯著差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 TUNEL 表達(dá)

正常組結(jié)腸組織見黏膜上皮有陽性表達(dá)，模型組大鼠腸黏膜固有層見少許淋巴細(xì)胞陽性表達(dá)，在SB203580組中，TUNEL 染色陽性淋巴細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯增加。見表2。

表2 各組大鼠腸組織p-p38 及p-ATF2、Bcl-2 和Bax 表達(dá)變化情況［()，%］

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在凋亡調(diào)控基因調(diào)控下發(fā)生的細(xì)胞程序性死亡方式。研究資料表明，在潰瘍性結(jié)腸炎中，腸上皮細(xì)胞凋亡明顯增多，而淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞凋亡延遲，導(dǎo)致腸黏膜炎癥持續(xù)存在和進(jìn)展，而在正常的腸組織中腸上皮細(xì)胞少見凋亡［5，6］。p38MAPK 是絲氨酸/酪氨酸激酶，它是MAPK 家族中的重要成員，參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，與炎癥、腫瘤及其它多種疾病發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)［1］，該通路在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病也日益受到人們的關(guān)注，但其在潰瘍性結(jié)腸炎中對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控尚未見研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采取TNBS 誘導(dǎo)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎形成，觀察大鼠腸道組織中p38MAPK 通路激活情況以及腸組織中淋巴細(xì)胞的凋亡情況及調(diào)控蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示潰瘍性結(jié)腸炎模型組大鼠腸組織磷酸化p38MAPK 水平較正常組大鼠明顯增高，提示p38 蛋白激酶活化可能參與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程。研究證實(shí)［7］，p38MAPK 特異性抑制劑SB203580 并不影響p38MAPK 磷酸化，而是競爭性地結(jié)合于p38MAPK 的ATP 位點(diǎn)阻止其磷酸化下游靶點(diǎn)如ATF2，進(jìn)而阻斷p38MAPK 的酶活性，因此，磷酸化的ATF2 可反映p38MAPK 酶活性。本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)腸炎模型組大鼠腸組織中p-ATF2 表達(dá)明顯高于正常組，與p-p38 一致升高，而在使用SB203580 干預(yù)后，p-ATF2 表達(dá)明顯下降，p-p38表達(dá)無明顯變化，同時(shí)大鼠腸道黏膜炎癥損傷情況明顯減輕，進(jìn)一步證實(shí)p38 蛋白激酶通過活化下游靶ATF2 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。

p38MAPK 可通過多種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡，可參與Fas/FasL 途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可通過磷酸化P53、激活c-jun，c-fos，增強(qiáng)c-myc 表達(dá)等途徑參與細(xì)胞凋亡調(diào)控過程［8］，ATF2 可直接誘導(dǎo)Bcl-2 表達(dá)［9］，從而引起下游效應(yīng)。Bcl-2 是研究最早也是最受重視的細(xì)胞凋亡抑制基因，Bax 是其同源蛋白，Bax 形成同源二聚體時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而與Bcl-2 形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡功能，因此，Bcl-2/Bax 的比例是決定細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，潰瘍性結(jié)腸炎模型組Bcl-2 蛋白明顯上升，Bax 表達(dá)明顯下降，而SB203580 可下調(diào)Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡。

總之，本研究證實(shí)，潰瘍性結(jié)腸炎中p38MAPK 活化并通過上調(diào)ATF2 促進(jìn)Bcl-2 表達(dá)延遲淋巴細(xì)胞凋亡，腸組織中炎癥持續(xù)存在和發(fā)展。SB203580 可明顯降低ATF2 活性，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，減輕腸道炎癥損傷。提示p38MAPK 信號(hào)通路活化在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中作用重大，阻斷這一通路的治療有望成為UC治療的新途徑。

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