夏 風(fēng)，石小紅

(1.湖北省婦幼保健院，湖北 武漢 430070;2.嘉魚縣人民醫(yī)院)

本實驗觀察肌注重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(rmhTNF)對大鼠移植性肝腫瘤(Walker-256)生長的抑制作用，旨在為rmhTNF 臨床肝癌的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗中所用Wistar 大鼠共24 只，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供，注射用rmhTNF 由上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司提供，Walker-256 瘤株自上海醫(yī)藥研究所傳代。

1.2 方法

Walker-256 瘤株先傳代，約10d 后長出直徑約1.5cm 的腫瘤結(jié)節(jié)，再將腫瘤種植于肝左外葉，10d 后經(jīng)MRI 證實移植成功后，隨機(jī)分成3組，每組8 只。對照組肌注生理鹽水0.1ml，肌注1組(IM1組)肌注rmhTNF 16.7 萬u，肌注2組(IM2組)肌注rmhTNF 33.3 萬u，均為1次/d，連續(xù)10d后停止注射。

1.3 影像學(xué)檢查

分別于肌肉注射前及注射后14d 行MRI 檢查，測量腫瘤最大徑(d1)及最小徑(d2)，通過公式V=0.5×d1×d22計算腫瘤治療前后體積，分別用V1、V2 表示，對3組間腫瘤生長率(V2/V1)進(jìn)行比較。

1.4 病理學(xué)檢查

于移植術(shù)后14d，先行磁共振檢查，然后處死荷瘤大鼠，肝臟腫瘤標(biāo)本經(jīng)10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，分別切片染色。

2 結(jié) 果

所有動物均存活，MRI 檢查均發(fā)現(xiàn)肝臟左葉腫瘤。同對照組相比，肌肉注射rmhTNF 能明顯抑制大鼠Walker-256 移植瘤的生長(P＜0.05)，兩組不同劑量治療組間的抑瘤作用無顯著性差異，見表1。觀察腫瘤大體標(biāo)本及HE 染色切片，發(fā)現(xiàn)肌注組腫瘤中央組織壞死范圍較對照組廣泛，且壞死較徹底，腫瘤向周邊組織侵犯、擴(kuò)散也明顯少于對照組。

方差齊性檢驗方差齊同(P＞0.05)單因素方差分析F=5.045，P＜0.05，組間比較Student-Newman-Keuls 法肌注組與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，肌注組間無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 肌肉注射rmhTNF 的抑瘤作用［，mm3］

3 討論

天然TNF 是由激活的單核巨噬細(xì)胞、NK 細(xì)胞、T 細(xì)胞產(chǎn)生的多功能蛋白，包括TNF-α、TNF-β和TNF-γ，能夠相對特異性地殺傷多種腫瘤細(xì)胞，具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫效應(yīng)細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、參與免疫及炎癥反應(yīng)、抗菌、抗病毒、刺激細(xì)胞生長等多種生物學(xué)活性，通過多種因素的綜合作用導(dǎo)致瘤細(xì)胞壞死［1］。研究表明，TNF 在小劑量時難以發(fā)揮抑瘤效果［2］，必須在體內(nèi)必須達(dá)到一定的血藥濃度，才能夠發(fā)揮抑制或者殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但由于全身大劑量應(yīng)用TNF 可產(chǎn)生嚴(yán)重毒副作用［3］，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、食欲下降、頭痛、乏力、白細(xì)胞減少、肝功能異常、血壓下降、休克等，另外TNF 還有可能參與惡液質(zhì)的形成［4］以及免疫病理損傷過程，因此限制了其臨床應(yīng)用。通過第四軍醫(yī)大學(xué)與上海賽達(dá)生物藥業(yè)有限公司的合作，利用生物工程技術(shù)改造了天然TNF 構(gòu)型，進(jìn)而研制成rmhTNF，對比天然TNF，rmhTNF 的毒副作用明顯降低，并且可肌肉注射，其作用時間延長，臨床使用起來更加方便和安全。

rmhTNF 是將天然人TNF-α 基因的5’端1 至7個氨基酸編碼序列刪除，用Arg-Lys-Arg 編碼序列取代8、9、10 位Pro、Ser、Asp 的編碼序列，同時Phe 密碼子取代Leu157 的密碼子，產(chǎn)生新的突變基因，插入原核高表達(dá)載體從而構(gòu)建出高表達(dá)菌株［5］。研究表明其對多種實體瘤均有效［6］。TNF對腫瘤作用的實驗及臨床研究主要集中于與其他治療手段的結(jié)合使用上。本實驗結(jié)果顯示單用rmhTNF 對大鼠的移植性肝癌有顯著抑制作用，實驗中所使用的rmhTNF 劑量參考說明書推薦劑量。劑量加倍后療效亦無明顯增加，甚至對腫瘤生長的抑制作用稍有減弱，可能與TNF 受體飽和等因素有關(guān)。TNF-α 抗腫瘤作用的分子機(jī)理是由受體引發(fā)的信號傳導(dǎo)。當(dāng)TNF 與受體結(jié)合趨于飽和后，再增加劑量其效應(yīng)增強(qiáng)也會十分有限。臨床應(yīng)用中的關(guān)鍵也就是選擇一個合適的劑量，既能發(fā)揮最佳治療效果，又能減輕其不良反應(yīng)的發(fā)生。

Oldham 于1984年提出了生物反應(yīng)調(diào)節(jié)(biological response modifiers，BRM)的理論，同時提出了腫瘤生物治療(biotherapy)的概念。BRM 是指通過某種物質(zhì)或措施，直接或間接改變宿主對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生有利于宿主并不利于腫瘤治療效應(yīng)。由于生物治療既能直接作用于腫瘤，抑制或直接殺滅腫瘤細(xì)胞，又可通過調(diào)節(jié)機(jī)體生物反應(yīng)，通過其他多種生物因子的作用，抑制腫瘤生長或使腫瘤組織溶解，因此生物治療已成為繼手術(shù)、放療、化療等治療手段之后臨床上治療腫瘤的又一重要方法。

［1］Van Ostade X，Vandenabeele P，Everaerbt B，et al.Human TNF mutants with selective activity on the p55 receptor［J］.Nature，1993，361:266

［2］Blick M，Sherwin SA，Rosenblum M，et al.A phase study of recombinant tumor necrosis factor in cancer patients［J］.Cancer Res，1987，47:2986

［3］Schilling PJ，Murray JL，Markowitz AB.Novel tumor necrosis factor toxic effects［J］.Cancer，1992，69:256

［4］Guttridge DC，Mayo MW，Madrid LV，et al.NF-kB-induced loss of MyoD messenger RNA:Possible role in muscle decay and cachexia［J］.Science，2000，289:2363

［5］張英起，趙寧，李波，等.應(yīng)用基因工程方法制備新型重組人腫瘤壞死因子-?［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2002，18:402

［6］秦鳳展，鄭榮生，陳余清，等.注射用重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子治療惡性腫瘤Ⅲ期臨床觀察［J］.中國新藥雜志，2003，12:646