江 敏，石林娟，楊 毅*

(合肥工業(yè)大學(xué) 農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009)

硫代葡萄糖苷(glucosinolates，簡稱硫苷)是廣泛存在于十字花科植物中的含硫次級代謝產(chǎn)物[1-4]，其種類相當(dāng)豐富。硫苷及其降解產(chǎn)物具有活躍的生物化學(xué)特性，尤其是抗癌活性已受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，并得到廣泛的認(rèn)同[5-7]。硫苷的基本結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 硫苷的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of glucosinolates

根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的不同，可以將硫苷分為脂肪族、芳香族和吲哚族三類[8]。蘿卜硫苷(glucoraphanin)即4-甲基亞磺酰丁基硫代葡萄糖苷(4-methylsufinylbutyl glucosionlate)，R基為CH3SO(CH2)4，屬于脂肪族硫代葡萄糖苷，其降解產(chǎn)物為異硫代氰酸鹽，主要為蘿卜硫素[9]。蘿卜硫素是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的抗癌活力最強的一類異硫代氰酸鹽，它的抗癌作用已在大鼠的乳腺癌中得到充分的證明[10-11]。而現(xiàn)有的大多數(shù)蘿卜硫素的研究都是從十字花科蔬菜中直接提取蘿卜硫素的前體。

目前已報道的硫苷總量分析測試方法已很多[12]，單種硫苷的測定方法只有HPLC法和X射線熒光分析法，其中HPLC法經(jīng)ISO專家和歐洲標(biāo)準(zhǔn)委員會推薦[13]。目前，市面上所售的硫苷純品只有丙烯基硫苷和苯甲基硫苷，尚無蘿卜硫苷。因此，分離純化蘿卜硫苷對于蘿卜硫素和其他種類硫苷的研究都具有現(xiàn)實意義。

西蘭花種子中蘿卜硫苷的含量(20～50mg/g)是成熟植株的60～70倍，是提取蘿卜硫苷的較優(yōu)原料。本實驗研究陰離子交換和制備色譜結(jié)合的方法，快速有效地分離純化蘿卜硫苷，并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，研究一種從西蘭花籽中提取分離蘿卜硫苷的實用方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花籽購于鑫雅花卉園藝公司。

甲醇、乙腈(均為色譜純) 美國Tedia公司；DEAE Sephadex A-25 美國Pharmacia公司；四甲基溴化銨(分析純) 阿拉丁試劑(上海)有限公司；咪唑(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸、醋酸鈉、硫酸鉀(分析純) 廣東汕頭市西隴化工廠；實驗用水為超純水，由純水發(fā)生器制得。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器、996二極管陣列檢測器) 美國Waters公司；高效液相色譜儀配UV3000B紫外檢測器 安徽皖儀科技股份有限公司；API3200質(zhì)譜儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Nocilet 5700傅里葉紅外光譜儀 美國熱電公司；Bruker AV400型核磁共振儀 瑞士Bruker Biospin公司；Ultra pure超純水機上海和泰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝

參照參考文獻(xiàn)[13]的硫苷提取方法并稍作修改。稱取西蘭花籽10g，于烘箱中100℃滅酶1h。然后研磨粉碎，并在索氏提取器中用正己烷脫脂，室溫晾干，制得脫脂西蘭花籽備用。

稱取脫脂后的西蘭花籽2g于離心管中，加入20mL沸甲醇-水溶液(70:30，V/V)，75℃水浴10min，其間每隔2min取出離心管在渦旋混合器上渦旋混合，然后取出離心管冷卻至室溫，5000×g離心3min，取出上清液。再向離心管中加入20mL沸甲醇-水溶液，重復(fù)以上操作，合并上清液。取提取液加入到DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝膠離子交換柱中，待溶液流干后，用40mL 0.02mol/L醋酸鈉溶液洗滌，再用40mL水沖洗。最后用40mL 0.5mol/L硫酸鉀溶液洗脫，收集洗脫液，供制備色譜用。

1.3.2 分析型HPLC分離條件

色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-AP(4.6mm×200mm，5μm)；流動相：乙腈-水(2:98，V/V)含0.1%甲酸；流速：1.0mL/min；檢測波長：229nm。

1.3.3 MS檢測條件

離子源：電噴霧電離(ESI)；離子極性：負(fù)離子；毛細(xì)管電壓：4500V；去簇電壓：－20V；針泵流速：5μL/min；掃描離子范圍：300～600m/z。

1.3.4 制備色譜分離條件

參照分析型HPLC分離條件，并對流動相進(jìn)行優(yōu)化。得到液相色譜分離條件。

色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-AP(10mm×250mm，10μm)；流動相：乙腈-水(2:98，V/V)含0.1%甲酸；流速：5mL/min；檢測波長：229nm。

1.3.5 紅外光譜分析條件

樣品采用KBr壓片法通過Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀進(jìn)行檢測。

1.3.6 HPLC-紫外光譜分析條件

樣品用純水溶解，采用Waters 996二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測。

色譜柱：Global Chromatography SP-120-5-C18-AP(4.6mm×200mm，5μm)；流動相：乙腈-水(2:98，V/V)含0.1%甲酸；流速：1.0mL/min；掃描波長范圍為190～400nm。

1.3.7 核磁共振氫譜分析條件

樣品用CD3OD溶解，采用超導(dǎo)核磁共振儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析型HPLC分離條件

粗提液在分析型高效液相色譜柱上分離，以乙腈-水體系作為流動相，加入0.1%四甲基溴化銨和甲酸，分離結(jié)果類似，色譜峰都得到了很好的分離，圖2為流動相中加0.1%甲酸的色譜圖。

圖2 蘿卜硫苷的液相色譜分離圖Fig.2 HPLC separation of glucoraphanin extracted from broccoli seeds

2.2 MS鑒定結(jié)果

對2.1節(jié)中的1～4號峰，按保留時間收集后進(jìn)行質(zhì)譜檢測。采用負(fù)離子模式的ESI-MS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰2產(chǎn)生離子碎片m/z435[M－]，提示其相對分子質(zhì)量為436，對應(yīng)蘿卜硫苷的相對分子質(zhì)量，這與Rochfort等[16]的結(jié)論相一致，結(jié)果見圖3。

圖3 蘿卜硫苷的MMSS圖Fig.3 MS spectrum of glucoraphanin

2.3 制備色譜分離條件的選擇

粗提取的蘿卜硫苷為硫苷鉀鹽類物質(zhì)，根據(jù)分析型HPLC條件，選擇乙腈-水體系作為流動相。四甲基溴化銨作為離子交換劑加入到流動相中能夠使硫苷很好的分離，但是其在提純物中的殘留不易除去，所以制備色譜流動相中不宜加入無機鹽。而甲酸由于其揮發(fā)性，容易分離除去，故選擇甲酸作為pH值調(diào)節(jié)劑，實驗表明加入甲酸后分離效果與前者相似，蘿卜硫苷有很好的分離效果，分離情況見圖4。多次收集蘿卜硫苷峰(圖4)，將收集液減壓濃縮后，經(jīng)冷凍干燥得到蘿卜硫苷的提純物。

圖4 蘿卜硫苷的液相制備色譜圖Fig.4 Preparative HPLC chromatogram of glucoraphanin

2.4 紅外光譜測定結(jié)果

圖5 蘿卜硫苷的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectrum of glucoraphanin

根據(jù)紅外譜圖(圖5)分析，3340cm-1處的較強吸收峰對應(yīng)O—H的伸縮振動；2916cm-1對應(yīng)飽和C—H伸縮振動；1567cm-1對應(yīng)C＝N的伸縮振動；1110cm-1和1059cm-1對應(yīng)葡萄糖苷上的C—O伸縮振動；986cm-1對應(yīng)S＝O的伸縮振動；803cm-1對應(yīng)C—S的伸縮振動。

2.5 HPLC-紫外光譜測定結(jié)果

圖6 蘿卜硫苷的UUVV圖Fig.6 UV absorption spectrum of glucoraphanin

在二極管陣列檢測器上，樣品的液相色譜峰2號峰(蘿卜硫苷)的紫外譜圖(圖6)顯示在波長228.6nm處有最大吸收峰，對應(yīng)了S—C＝N在紫外區(qū)的特征吸收。

2.6 核磁共振氫譜法

由1H NMR圖(圖7)可以觀察到不活潑氫的氫峰。δ=4.7為H2O峰，δ=3.41－3.82(5H,吡喃環(huán)上的H)，δ=3.87(2H,－CH2*OD)，δ=2.80(2H,－CNCH2*－CH2－)，δ=1.89(2H,－CN－CH2－CH2*－)，δ=1.91(2H,－CN－CH2－CH2－CH2*－)，δ=2.95(2H,－CH2*－SO－CH3)，δ=2.71(3H, －CH2－SO－CH3*)。

圖7 蘿卜硫苷的核磁共振氫譜圖Fig.7 1H NMR spectrum of glucoraphanin

上述分析最終確定所得到的硫苷提取物為蘿卜硫苷結(jié)構(gòu)，見圖8。

圖8 蘿卜硫苷結(jié)構(gòu)示意圖Fig.8 Chemical structure of glucoraphanin

3 結(jié) 論

對西蘭花籽進(jìn)行溶劑提取、陰離子交換、液相制備色譜分離純化后，再采用質(zhì)譜、紅外、紫外檢測光譜和核磁共振等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，最終確定產(chǎn)品為蘿卜硫苷結(jié)構(gòu)。通過本方法制備的蘿卜硫苷對于蘿卜硫素和其他種類硫苷的研究具一定參考價值。

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