馬永華，陳文妃，陳凌云，韋俊濤，郁有健，朱祝軍,2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300）

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GS）又稱芥子油苷，是一類富含氮、硫的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要存在于十字花科Cruciferae植物中［1］。它在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，硫苷及其水解產(chǎn)物有著非?；钴S的生物學(xué)活性，主要包括參與植物的防御反應(yīng)、賦予植物不同的風(fēng)味、抗癌、抗?fàn)I養(yǎng)作用等［2］。盡管所有十字花科植物均能合成硫苷，但不同品種之間硫苷種類和含量各不相同，其含量隨生長(zhǎng)階段而改變［3］，且受到諸多因素影響，如日照長(zhǎng)短、損傷、病害等［4］。有關(guān)研究表明，油菜Brassica napus開花數(shù)天后不同器官硫苷含量起伏較大，均未表現(xiàn)出穩(wěn)定的變化趨勢(shì)［5］。宋志榮等［6］研究發(fā)現(xiàn)：甘藍(lán)型油菜不同品種硫苷含量變化趨勢(shì)不一致，高硫苷品種苗期葉片含量最高，從苗期到盛花期呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，低硫苷品種硫苷含量從苗期到盛花期上下波動(dòng)。李培武等［7］研究證實(shí)，在不同甘藍(lán)型油菜的不同生長(zhǎng)期，硫苷含量差異顯著，且與時(shí)間的變化趨勢(shì)不一致。硫苷的生物學(xué)活性研究已較清晰，但對(duì)于小白菜Brassica rapassp.chinensis生長(zhǎng)過程中硫苷組分和含量變化的研究相對(duì)較少。由于植物在生長(zhǎng)過程中，硫苷含量受合成、運(yùn)輸和代謝等多方面的影響，不同種類的硫苷在植物防御體系中發(fā)揮的作用不盡相同。本試驗(yàn)研究了小白菜不同生長(zhǎng)期和同時(shí)期不同葉位硫苷組分和含量變化，以期探究硫苷在小白菜中的分布，為硫苷在植物抗逆性方面的運(yùn)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)與處理

供試材料為小白菜 ‘黑油冬’ ‘Heiyoudong’（購(gòu)于上海菲托種子有限公司）。試驗(yàn)于 “GXZ-500D型”智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)（購(gòu)于寧波江南儀器廠），晝夜溫度設(shè)置為（27±1）℃，光照強(qiáng)度3萬(wàn) lx，日照長(zhǎng)度為14 h，將種子播于5×10裝有基質(zhì)的穴盤中，待幼苗長(zhǎng)到四葉一心時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至上口徑11 cm的育苗盆中。分別在四葉期、八葉期和十二葉期以及八葉期的不同葉位，選取完好無(wú)損的葉片進(jìn)行取樣，去除主脈剪碎后液氮速凍，于－80℃冰箱中保存，每個(gè)葉期設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2 儀器與方法

真空冷凍干燥機(jī)（1-16LSC，CHRIST），固相萃取儀（ASE-12，天津奧特賽恩斯儀器有限公司），高效液相色譜儀（1200，安捷倫）等。參考KRUMBEIN等［8］和ZHU等［9］的方法并加以改進(jìn)。將上述樣品置于凍干機(jī)內(nèi)凍干72 h，完全去除組織水分后，用磨粉機(jī)將其磨成粉末并置于塑封袋內(nèi)保存，在磨粉過程中務(wù)必將空調(diào)開啟除濕模式，以防止樣品受潮。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用鄧肯新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)（Duncan’s ANOVA），在5%水平進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同葉期的硫苷質(zhì)量摩爾濃度

圖1表明了 ‘黑油冬’在不同時(shí)期總硫苷、脂肪族硫苷、芳香族硫苷和吲哚族硫苷質(zhì)量摩爾濃度的變化。在四葉期、八葉期和十二葉期，葉片硫苷質(zhì)量摩爾濃度不同。從四葉期到八葉期，硫苷質(zhì)量摩爾濃度呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），在八葉期達(dá)到峰值，而在十二葉期有所下降。其中，脂肪族硫苷質(zhì)量摩爾濃度隨著葉期的生長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸的下降趨勢(shì)，在十二葉期時(shí)達(dá)到最低。吲哚族硫苷和芳香族硫苷質(zhì)量摩爾濃度的變化趨勢(shì)與總硫苷的變化趨勢(shì)一致，八葉期時(shí)最高，四葉期和十二葉期較低。另外，在不同時(shí)期脂肪族硫苷、芳香族硫苷和吲哚族硫苷占總硫苷的比例不同。四葉期時(shí)，脂肪族硫苷的占比最高，約占總硫苷的65%；八葉期時(shí)，吲哚族硫苷占比最大，占總硫苷的48%；十二葉期脂肪族硫苷與吲哚族硫苷的質(zhì)量摩爾濃度相當(dāng)。在3個(gè)時(shí)期中，芳香族硫苷所占比例最低。

圖1 不同時(shí)期總硫苷和各類硫苷的質(zhì)量摩爾濃度Figure 1 Content of total glucosinolates and various types of glucosinolates in different periods

2.2 不同葉位硫苷質(zhì)量摩爾濃度

‘黑油冬’小白菜在八葉期時(shí)硫苷質(zhì)量摩爾濃度最高，因此選取了八葉期對(duì)其進(jìn)行不同葉位硫苷質(zhì)量摩爾濃度的分析。根據(jù)葉齡大小從上葉位到下葉位依次命名為Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6和Y7，葉片長(zhǎng)度小于5 cm的統(tǒng)稱為Y0（菜心）。由圖2可見：隨著葉位的升高，硫苷質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)逐漸的上升趨勢(shì)。Y7，Y6和Y5葉位之間，硫苷質(zhì)量摩爾濃度有所上升但差異不顯著 （P＞0.05），Y4和Y3葉位較下葉位硫苷質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)（P＜0.05），但Y4和Y3之間硫苷質(zhì)量摩爾濃度差異不顯著（P＞0.05），其質(zhì)量摩爾濃度分別為0.57和0.73 μmol·g－1。越靠近菜心部位硫苷升高的幅度越大，Y3，Y2和Y1葉位硫苷質(zhì)量摩爾濃度都較其下葉位呈現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)（P＜0.05），其中菜心部位的硫苷質(zhì)量摩爾濃度高達(dá)4.35 μmol·g－1。脂肪族硫苷在不同葉位的變化趨勢(shì)與總硫苷的變化趨勢(shì)一致，其質(zhì)量摩爾濃度由下葉位至上葉位逐漸上升，在菜心部位達(dá)到最高，為2.55 μmol·g－1，而吲哚族硫苷質(zhì)量摩爾濃度隨著葉位上升呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在Y5葉位最低，僅為0.08 μmol·g－1，菜心部位達(dá)到最高，為1.60 μmol·g－1。芳香族硫苷的質(zhì)量摩爾濃度相對(duì)較低，且在Y4，Y5，Y6和Y7葉位沒有檢測(cè)到該類硫苷的存在。其他葉位芳香族硫苷的變化與總硫苷的變化趨勢(shì)一致，菜心部位達(dá)到最高的0.19 μmol·g－1。在占比方面，吲哚族硫苷在Y7葉位所占比例最高，約為總硫苷的56.7%，其他葉位則以脂肪族硫苷為主，占比59.0%～79.0%，芳香族硫苷在所有葉位中質(zhì)量摩爾濃度較低，所占比例低于7.1%。

3 討論

BROWN等［10］從擬南芥Arabidopsis thaliana生長(zhǎng)周期的不同階段發(fā)現(xiàn)，不同器官的硫代葡萄糖苷質(zhì)量摩爾濃度和種類存在顯著差異。休眠和已發(fā)芽種子硫苷質(zhì)量摩爾濃度最高，其次為花序、長(zhǎng)角果（果實(shí)）、根、莖和葉［11］。雖然脂肪族硫苷質(zhì)量摩爾濃度在大多數(shù)植物器官中占主導(dǎo)地位，但吲哚族硫苷質(zhì)量摩爾濃度在根部和蓮座葉末期占總硫苷質(zhì)量摩爾濃度的近一半。在擬南芥中，GTR1和GTR2參與脂肪族硫苷而不是吲哚族硫苷的雙向長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)，蓮座葉期葉片是短鏈脂肪族硫苷主要的來源和儲(chǔ)存位置，根部和葉片合成的長(zhǎng)鏈脂肪族硫苷主要運(yùn)輸?shù)礁績(jī)?chǔ)存［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)： ‘黑油冬’在不同葉期葉片硫苷質(zhì)量摩爾濃度由四葉期到八葉期上升，十二葉期下降的變化趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果［13］基本一致，不同的是脂肪族硫苷的變化趨勢(shì)和其所占總硫苷的比例有所差異，可能是由于培養(yǎng)條件的不同所致。表明 ‘黑油冬’葉片在不同生長(zhǎng)期的硫苷質(zhì)量摩爾濃度變化較大。一般來說，硫苷在植物體內(nèi)是不斷積累的，而十二葉期硫苷質(zhì)量摩爾濃度下降可能是因?yàn)榱蜍盏姆e累速率遠(yuǎn)不及植物的生長(zhǎng)速率，從而表現(xiàn)為單位質(zhì)量的降低［10］，也可能是由于隨著植株的生長(zhǎng)，葉片新合成的硫苷被運(yùn)輸?shù)街参锏那o和根部等器官所致［12］，由此在葉片中形成硫苷的動(dòng)態(tài)平衡。脂肪族硫苷在葉片中占主要地位，其質(zhì)量摩爾濃度隨葉期增加而逐漸降低，可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GTR1和GTR2參與長(zhǎng)鏈脂肪族硫苷的長(zhǎng)距離運(yùn)輸，將其運(yùn)輸?shù)礁克拢?2，14］。

圖2 不同葉位總硫苷和各類硫苷的質(zhì)量摩爾濃度Figure 2 Contents of total glucosinolates and various types of glucosinolates in different leaves

從發(fā)育的角度來看，擬南芥幼嫩的蓮座葉通常比老葉硫苷質(zhì)量摩爾濃度更高，這是因?yàn)樵缙谏L(zhǎng)的葉片在其生長(zhǎng)過程中每克干物質(zhì)增加的硫苷累積量低［10］。蓮座葉期葉片在葉片擴(kuò)張時(shí)硫苷質(zhì)量摩爾濃度相對(duì)穩(wěn)定。在種子發(fā)芽和葉片衰老期間，硫苷質(zhì)量摩爾濃度顯著下降［15］。EAS等［16］的研究表明：甘藍(lán)結(jié)球部位的硫苷質(zhì)量摩爾濃度顯著高于外部葉片。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ‘黑油冬’不同葉位硫苷質(zhì)量摩爾濃度的變化，內(nèi)部葉片較外部葉片具有更高的硫苷質(zhì)量摩爾濃度，Y4和Y3葉位硫苷變化不大，衰老葉片硫苷質(zhì)量摩爾濃度最低，這與前人的研究結(jié)果［10，15］相一致。陳新娟［17］在小白菜不同葉位中硫苷質(zhì)量摩爾濃度的研究發(fā)現(xiàn)，葉片膨大期硫苷質(zhì)量摩爾濃度最高。在露地栽培條件下，環(huán)境中的病蟲害會(huì)顯著增加硫苷質(zhì)量摩爾濃度［18-19］。

硫苷在病蟲害防御中發(fā)揮重要作用，在植物中的分布并不均勻。在葉片中，硫苷的分布主要位于植物易受攻擊的位置，如葉表面或葉緣部［20］。小白菜同一時(shí)期不同葉位之間的硫苷質(zhì)量摩爾濃度存在顯著差異，說明植物為適應(yīng)環(huán)境有選擇性地將硫苷分配至植株的重要部位，同時(shí)將衰老葉片中的硫苷運(yùn)送到其他組織器官，使植物的防御能力達(dá)到最優(yōu)，這是由植株特有的生理及防御機(jī)制決定的。通常情況下，硫苷分布在植物整個(gè)發(fā)育過程中所有的營(yíng)養(yǎng)和生殖器官中。研究小白菜不同時(shí)期以及不同葉位的硫苷質(zhì)量摩爾濃度變化規(guī)律，有助于探究硫苷在小白菜中的分布以及明確硫苷在小白菜中的代謝機(jī)理。