李麗英 譙時(shí)文 李東

（樂(lè)山職業(yè)技術(shù)學(xué)院人體解剖教研室，四川 樂(lè)山614000）

新生血管是指在已存在的血管基礎(chǔ)上，通過(guò)發(fā)芽或分支方式所形成的新血管。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴(lài)于血管的生成［1］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）家族中，VEGF－A在腫瘤血管新生中發(fā)揮著重要作用，它能促使內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)新生血管形成，還能增加血管通透性［2］。VEGF－A的這些生物學(xué)效應(yīng)主要是通過(guò)其血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，又含激酶插入?yún)^(qū)的受體（Human kinase insert domain containing receptor，KDR）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。KDR是1992年 Terman［3］等最早從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫(kù)中，應(yīng)用與已知受體酪氨酸激酶的同源產(chǎn)物擴(kuò)增獲得。研究證明，靶向敲除KDR基因，將導(dǎo)致血島形成損傷，并缺乏成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，從而使小鼠胚胎于第8.5～9.5d死亡［4］。在成年小鼠中，即使是通過(guò)藥物短期阻斷VEGF－A與KDR之間的相互作用，仍然會(huì)引起血管退化［5］。鑒于KDR在VEGF－A／KDR信號(hào)通路中的重要作用，我們采用雜交瘤技術(shù)制備能穩(wěn)定分泌抗KDR單克隆抗體（Monoclonal Antibody，mAb）的雜交瘤細(xì)胞，以期獲得能抑制VEGFA生物學(xué)效應(yīng)的抗KDR mAb。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡、18～20g雌性清潔級(jí)BALB／c小鼠6只，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK（川）2009－045。小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0－Ag14、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶蛋白（Glutathione S－transferases，GST）、GST－KDR融合蛋白，由四川大學(xué)免疫學(xué)教研室提供。次黃嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶T、聚乙二醇等購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立

用純化的GST－KDR蛋白作為免疫原，常規(guī)皮下免疫BALB／c小鼠2只，50μg·只－1，共4次；末次加強(qiáng)免疫后3d，取小鼠脾臟通過(guò)機(jī)械分離法制成脾細(xì)胞懸液，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2／0－Ag14在聚乙二醇介導(dǎo)下融合，采用雜交瘤技術(shù)建立分泌抗KDR mAb的雜交瘤細(xì)胞株。

1.2.2 最佳抗原包被濃度的確定及抗KDR mAb的檢測(cè)

按照間接酶聯(lián)免疫法（Enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行，以GST－KDR融合蛋白進(jìn)行包板，該蛋白濃度為1.6mg·mL－1。先用碳酸鹽緩沖液對(duì)GST－KDR融合蛋白進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?倍倍比稀釋?zhuān)捶謩e為1、1／2、1／4、1／8、1／16、1／32、1／64、1／128、1／256。再通過(guò)間接 ELISA 法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液。

1.2.3 抗KDR mAb的大量制備及純化

取雌性BALB／c小鼠4只，每只BALB／c小鼠腹腔內(nèi)注射0.5mL液體石蠟，7d后將建株的雜交瘤細(xì)胞（5×106細(xì)胞·只－1）接種于小鼠腹腔。10～14d后收集腹水，按飽和硫酸銨法進(jìn)行鹽析，G－Sephrose 4B親和層析純化，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度。

1.2.4 抗KDR mAb效價(jià)的測(cè)定

采用間接ELISA法測(cè)定純化后抗KDR mAb的效價(jià)。以（測(cè)定孔A450值／陰性對(duì)照孔A450值）≥2.1為陽(yáng)性，選擇陽(yáng)性孔中的最高稀釋度即為抗KDR mAb的效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立

融合細(xì)胞接種于4塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，融合后7～10d，觀察到雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔352孔，細(xì)胞融合率為91.7%；初選特異性陽(yáng)性克隆細(xì)胞33孔，陽(yáng)性率為8.7%。4～5d后，取單克隆培養(yǎng)孔上清液，利用間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，最終獲得4株只針對(duì) KDR的雜交瘤細(xì)胞株，分別是1E8、1F1、2B8、3E9。經(jīng)有限稀釋法，對(duì)陽(yáng)性克隆孔2B8、3E9進(jìn)行反復(fù)亞克隆，最終獲得1株能穩(wěn)定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E9 B2G11。

2.2 包被抗原最佳濃度的確定

通過(guò)間接ELISA法測(cè)得GST－KDR包被抗原濃度在2倍倍比濃度稀釋下對(duì)應(yīng)的A450值，以GST－KDR包被抗原濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度A450值為縱坐標(biāo)，通過(guò)Excel軟件繪制出圖1，曲線接近水平狀態(tài)時(shí)的抗原最高稀釋濃度為抗原的最佳包被濃度。由圖1可看出GST－KDR抗原的最佳包被濃度是10μg· mL－1（見(jiàn)圖1）。

2.3 抗KDR mAb的蛋白濃度測(cè)定

牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用雙蒸水倍比稀釋?zhuān)?52型紫外分光光度儀測(cè)定A280值，繪制吸光度值－標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA系列濃度梯度曲線（見(jiàn)圖2）。將濃縮純化腹水樣品稀釋10倍進(jìn)行測(cè)定，其A280值為0.42，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)Excel軟件FORECAST線性回歸統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算出抗KDR mAb的蛋白濃度為6.1mg·mL－1。

2.4 抗KDR mAb的效價(jià)測(cè)定

由間接ELISA法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞株3E9B2G11所分泌的抗體效價(jià)為1∶16384。

圖1 吸光度－ （GST－KDR）包被抗原濃度梯度曲線

圖2 吸光度值－標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA系列濃度梯度曲線

3 討論

早在1971年，F(xiàn)olkman［6］就提出腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移離不開(kāi)血管生成，無(wú)論何種抗腫瘤新生血管形成的技術(shù)都將是對(duì)現(xiàn)有腫瘤治療學(xué)的強(qiáng)有力的補(bǔ)充?？寡苌芍委熌[瘤的策略是：通過(guò)阻斷腫瘤組織中血管生長(zhǎng)因子對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用來(lái)阻止新生血管形成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前有許多觀點(diǎn)趨向于采用KDR作為阻斷腫瘤血管新生治療的最佳靶點(diǎn)，理由如下［7］：1）KDR主要表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞，如腫瘤位點(diǎn)；2）由于腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞與血液直接接觸，使KDR受體抑制劑更容易達(dá)到靶細(xì)胞；3）VEGF家族中，除VEGF－A外，其它成員如VEGF－C、－D、－E也可作為KDR的配體；因此，采用KDR受體抑制劑可潛在阻斷它們的刺激作用。Michael［8］等對(duì)49例婦科惡性腫瘤患者、61例婦科良性腫瘤患者及12例對(duì)照組的血清進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌等惡性腫瘤中，VEGF－A及磷酸化KDR的表達(dá)水平都顯著高于良性腫瘤及對(duì)照組。KDR高表達(dá)于被激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞上，若能抑制其活性，阻斷VEGF－A／KDR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，VEGF－A就不能發(fā)揮作用，從而達(dá)到抗腫瘤新生血管形成的目的。

為了能最大限度地封閉VEGF－A與內(nèi)源性KDR受體結(jié)合，我們以GST－KDR蛋白免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備能穩(wěn)定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)GST抗原和GST－KDR抗原都進(jìn)行包被，取單克隆細(xì)胞的上清液同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，觀察上清液與GST抗原、GST－KDR抗原的結(jié)合情況。通過(guò)間接ELISA法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，每次只選擇與GST－KDR蛋白反應(yīng)呈陽(yáng)性的克隆細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，分離出針對(duì)KDR單一抗原決定簇的B細(xì)胞克隆。經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)出只分泌抗GST－KDR蛋白抗體的細(xì)胞克隆后，利用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。經(jīng)過(guò)3次反復(fù)間接ELISA法檢測(cè)特異性抗體及反復(fù)亞克隆，得到了一株基因型穩(wěn)定并能穩(wěn)定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3E9B2G11。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，用GST－KDR蛋白免疫BALB／C小鼠，可獲得特異、穩(wěn)定分泌抗KDR mAb的雜交瘤細(xì)胞株。這為以后將該抗體改造成小分子酪氨酸激酶抑制劑，使其能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與受體KDR特異性結(jié)合并阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的強(qiáng)大生物學(xué)功能奠定了重要的基礎(chǔ)。

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