許龍巖 袁慕云 唐 勤 鄒志飛 相大鵬

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東廣州 510623;2.南方醫(yī)科大學(xué))

1 前言

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起醫(yī)院感染和細(xì)菌性食物中毒的一種主要病原菌，該菌可分泌20多種毒性蛋白質(zhì)［1，2］，日本的調(diào)查結(jié)果表明，平均32.5%的食品存在金黃色葡萄球菌的污染［3，4，］。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已有用普通 PCR或熒光 PCR 檢測(cè)金黃色葡萄球菌的報(bào)道［5，6，7］，雖然這些方法可達(dá)到快速、高通量的目的，但卻無(wú)法獲得分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)－DNA堿基序列，因此有假陽(yáng)性的可能。焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)技術(shù)是近年來發(fā)展的一項(xiàng)實(shí)時(shí)地進(jìn)行短片段DNA測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)在DNA序列分析時(shí)不需要電泳和熒光標(biāo)記，直接測(cè)定測(cè)序引物后面的堿基序列，通過提供可靠的序列信息來確認(rèn)PCR產(chǎn)物，同時(shí)由于主要分析PCR產(chǎn)物雙鏈中的一條鏈的序列，避免了由于DNA鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的人工假象，使測(cè)序結(jié)果更加準(zhǔn)確［8］，目前應(yīng)用于基因表達(dá)［9］、病毒檢測(cè)［10］、SNP 分析［11］、耐藥基因檢測(cè)［12］、真菌鑒定［13］、DNA甲基化分析［14］等多個(gè)領(lǐng)域。

本研究根據(jù)金黃色葡萄球菌凝固酶基因保守序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，建立了結(jié)合PCR－焦磷酸測(cè)序從DNA堿基序列水平上檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，并評(píng)價(jià)了方法的特異性、與傳統(tǒng)檢測(cè)方法的符合性，以期實(shí)際應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株來源

金黃色葡萄球菌共20株，其中標(biāo)準(zhǔn)菌株1株，不同食品中的分離株19株，菌株信息見表1。陰性對(duì)照菌株8株，分別為單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌 ATCC29544、藤黃微球菌CMCC28001、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、糞鏈球菌ATCC2921、大腸桿菌ATCC25922。上述菌株來自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心、中國(guó)藥品生物制品鑒定所和廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，所有菌株均經(jīng)VITEK 2和API試劑條進(jìn)行了確證。

表1 金黃色葡萄球菌菌株信息

2.1.2 主要儀器和試劑

焦磷酸測(cè)序PyroMark lD系統(tǒng)：瑞典Biotage公司;7900PCR擴(kuò)增儀：美國(guó)PE公司;全自動(dòng)核酸純化系統(tǒng)12GC：日本 PSS公司;PCR用 Buffer、dNTP、瓊脂糖、PCR分子量標(biāo)記(50－500bp)Taq酶，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;鏈親和素標(biāo)記磁珠：GE.Healthcare公司;焦磷酸測(cè)序用酶、dNTP、結(jié)合緩沖液、退火緩沖液、變性緩沖液、洗滌緩沖液等購(gòu)自QIAGEN上海辦事處;7.5%氯化鈉肉湯：北京陸橋有限公司。

2.2 方法

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的金黃色葡萄球菌凝固酶基因序列中的保守區(qū)域，用PyroMark Assay Design軟件設(shè)計(jì)引物和測(cè)序引物，上游引物5'－AGCCATTAGTTAAAATTCCACAGG －3'，下游引物 5'－TTTAGATGAGCTACCTTCAAGACC －3'，測(cè)序引物5'－CTTTAAGCGATAATTATACT －3'，下游引物 5'端標(biāo)記生物素，擴(kuò)增片段大小為215bp，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。

2.2.2 模板制備

所有菌株均用7.5%氯化鈉肉湯36℃培養(yǎng)18－24h，取1mL菌懸液移入離心管，12000 r/min離心5min去上清，用1mL去離子水漂浮沉淀，12000 r/min離心3min去上清，重復(fù)2次，最后加200μL去離子水在核酸提取儀上提取DNA，用于PCR擴(kuò)增。

2.2.3 PCR擴(kuò)增體系及電泳參數(shù)

擴(kuò)增體系 50μL：PCR Mix Buffer25μL，Taq 酶5μL，MgCl21μL，10μmol/L 上、下游引物各 2μL，模板1μL，去離子水14μL。循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性95℃5min;95℃15s，65℃ 30s，72℃ 30s，45 個(gè)循環(huán);72℃12min，4℃保存。PCR產(chǎn)物一部分在2%瓊脂糖凝膠上電泳，另一部分用于焦磷酸測(cè)序。

2.2.4 單鏈模板制備及焦磷酸測(cè)序

將15μL PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，加入2μL磁珠，20μL結(jié)合緩沖液和 43μL純水，常溫震蕩混20min;打開真空泵，將真空預(yù)裝工具 prep tool在高純水中清洗30 s，將prep tool移到96孔PCR板中，抓取其中的磁珠，待磁珠基本抓取完畢后將攜帶有磁珠的prep tool放入70%乙醇中5 s，再分別在變性緩沖液和洗滌緩沖液中各清洗20－30s，prep tool放在裝有退火預(yù)混液 PSQ 96板(預(yù)先加入43μL退火緩沖液和2μL測(cè)序引物)的上方，關(guān)掉真空泵，輕輕搖動(dòng)釋放磁珠，將PSQ 96板在80℃放置5min，自然冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序程序采用SQA模式，按ATCG的堿基排列順序，依次循環(huán)加入15次，根據(jù)軟件給出的劑量在試劑倉(cāng)中加入底物混合物、酶混合物和4種脫氧核糖核苷酸，將PSQ96孔板和試劑倉(cāng)放入PyroMark lD系統(tǒng)中進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。測(cè)序峰及相應(yīng)的DNA堿基序列由儀器SQA軟件自動(dòng)分析產(chǎn)生。

2.2.5 焦磷酸測(cè)序結(jié)果判斷

檢測(cè)的DNA堿基序列與測(cè)序引物后的DNA堿基序列比對(duì)判斷結(jié)果，即檢測(cè)的前29個(gè)DNA堿基序列為 CAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGA，則判斷為金黃色葡萄球菌。

2.2.6 模擬樣品檢測(cè)

用均質(zhì)帶分別秤取25g豬肉、對(duì)蝦，每份樣品中加入225mL 7.5%氯化鈉肉湯緩沖蛋白胨水，分別加入1mL用已調(diào)好濃度的102cfu/mL金黃色葡萄球菌CMCC26003菌懸液，用拍擊式均質(zhì)器拍打2 min，36℃ 培養(yǎng)18－20h，然后取一部分按上述步驟提取DNA進(jìn)行焦磷酸檢測(cè)，另一部分按GB4789.10－2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

凝固酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，20株金黃色葡萄球菌均擴(kuò)增出215bp大小的DNA片段(圖1)，而單增李斯特氏菌、阪崎腸桿、藤黃微球菌、痢疾志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、肺炎克雷伯氏菌、糞鏈球菌、大腸桿菌等對(duì)照菌株未見擴(kuò)增條帶(圖2)，表明設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物具有較好的特異性，能特異性地?cái)U(kuò)增金黃色葡萄球菌。

圖1 金黃色葡萄球菌凝固酶基因PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 金黃色葡萄球菌特異性試驗(yàn)PCR擴(kuò)增電泳圖

3.2 焦磷酸測(cè)序結(jié)果

20株金黃色葡萄球菌焦磷酸測(cè)序結(jié)果，根據(jù)模版濃度等條件的不同，測(cè)出38－44bp長(zhǎng)短不等的DNA堿基序列(表2，圖3－圖4，其他測(cè)序結(jié)果圖略)，而單增李斯特菌等8株對(duì)照株未測(cè)出DNA堿基序列。測(cè)序所得20株金黃色葡萄球菌DNA堿基序列，分別與測(cè)序引物后的 DNA序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)100%匹配的DNA堿基數(shù)為29－44bp，所有有效測(cè)序結(jié)果均超過29個(gè)堿基(表2)，表明測(cè)序引物的特異性較好，并且可用CAACC GACGACACCG AACCCTATTT TAGA的DNA堿基序列特異性地檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

表2 金黃色葡萄球菌焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

(續(xù)表)

3.3 模擬樣品焦磷酸測(cè)序檢測(cè)結(jié)果

添加金黃色葡萄球菌CMCC26003菌懸液的豬肉、對(duì)蝦模擬樣品，分別檢測(cè)出與預(yù)期相符的DNA堿基序列，即CAACC GACGACACCG AACCCTATTT TAGA(圖略)。按照 GB4789.10－2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》檢測(cè)的模擬樣品，均分離鑒定出金黃色葡萄球菌，結(jié)果與本研究建立的焦磷酸測(cè)序方法一致。

圖3 BJ CMCC26003焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖

圖4 JP1焦磷酸測(cè)序結(jié)果圖

4 討論

致病性較強(qiáng)的金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生凝固酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著于細(xì)菌表面成塊，凝塊包繞細(xì)菌使其免遭抗生素、抗體、吞噬等多種因素的作用。葡萄球菌有2種凝固酶，一種是分泌至菌體外的蛋白質(zhì)稱為游離凝固酶，此酶與血漿中的凝固酶反應(yīng)因子協(xié)同作用于纖維蛋白原，使血漿凝固，故可用試管法檢出;另一種結(jié)合于菌體表面并不釋放，稱為結(jié)合凝固酶或凝聚因子，它可直接作用于纖維蛋白原，可用玻片法檢出。凝固酶因子試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)是兩個(gè)不相關(guān)試驗(yàn)，兩者不能相互替代，也不可相互印證。金黃色葡萄球菌既可產(chǎn)生凝固酶，亦可產(chǎn)生凝集因子，而血漿凝固酶試驗(yàn)是鑒定金黃色葡萄球菌致病性的關(guān)鍵。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.10－2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》，也將血漿凝固酶試驗(yàn)作為鑒定金黃色葡萄球菌的指標(biāo)［15，16，17］。

本研究根據(jù)血漿凝固酶基因DNA堿基序列中的保守區(qū)域，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，建立了PCR－焦磷酸測(cè)序從DNA堿基序列水平上檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，先對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，保證擴(kuò)增片段的特異性，再用擴(kuò)增產(chǎn)物制備單鏈模板，在測(cè)序引物的引導(dǎo)下進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，檢測(cè)的DNA堿基序列與測(cè)序引物后的序列比對(duì)，前29個(gè)堿基序列100%匹配作為陽(yáng)性結(jié)果，即序列為CAACC GACGACACCG AACCCTATTT TAGA，則判斷為金黃色葡萄球菌。PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果，擴(kuò)增引物具有較好的特異性，20株金黃色葡萄球菌均擴(kuò)增出215bp大小的DNA片段，而單增李斯特氏菌等其他對(duì)照菌株未擴(kuò)增出DNA條帶。焦磷酸測(cè)序結(jié)果，20株金黃色葡萄球菌DNA堿基序列與測(cè)序引物后的堿基序列比對(duì)，100%匹配的堿基數(shù)分別為29－44bp，均超過需檢測(cè)的29個(gè)DNA堿基序列，而其他單增李斯特氏菌等對(duì)照菌株未測(cè)出DNA堿基序列。模擬樣品檢測(cè)結(jié)果，焦磷酸測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)檢測(cè)方法一致，但在檢測(cè)周期上傳統(tǒng)方法需要培養(yǎng)、劃線分離、凝固酶試驗(yàn)等，需要2－3d，而焦磷酸測(cè)序方法增菌18－24h、核酸提取、PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序3h，整個(gè)試驗(yàn)21－27h完成，簡(jiǎn)便快捷，而且可通DNA堿基序列的水平上檢測(cè)金黃色葡萄球菌，避免了單純PCR擴(kuò)增檢測(cè)易污染造成的假陽(yáng)性結(jié)果，準(zhǔn)確性高，具有較好的應(yīng)用前景。

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