許崇輝 潘芳 溫巧玲 劉慧智 程樹軍 李妙珍

(廣東出入境檢驗檢疫局 廣東廣州 510623)

1 前言

戊二醛是一種具有揮發(fā)性和刺激性的化學試劑，主要用于皮革鞣制和作為殺菌劑［1］。在其生產(chǎn)使用過程中，可經(jīng)皮膚(粘膜)、經(jīng)呼吸道和經(jīng)口3個途徑進入人體而造成機體危害。急性毒性實驗表明［2］，戊二醛小鼠經(jīng)口 LD50為 248 mg/kgbw，大鼠經(jīng)口LD50為239 mg/kgbw，經(jīng)皮 LD50≥2000mg/kgbw，急性吸入毒性4h－LC50為768mg/m3，按急性毒性分級標準屬于中低毒性物質(zhì)。在現(xiàn)實生產(chǎn)和使用過程中，戊二醛的生產(chǎn)者和使用者暴露接觸的特點是：暴露接觸濃度不高，急性中毒風險較小，但進入機體的途徑多、暴露接觸時間長而可能存在化學物質(zhì)的遺傳毒性損害。

為了了解戊二醛對生產(chǎn)者和使用者遺傳毒性的危害程度，本研究對某品牌25%戊二醛溶液進行了Ames試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗的遺傳毒性試驗?，F(xiàn)將實驗檢測情況報告如下。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗菌株、動物

菌株及S9：鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型突變型菌株 TA97、TA98、TA100、TA102 和 S9，由廣州市疾控中心提供;

實驗動物：SPF級昆明種小鼠，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(粵)2008－0002;微核試驗、小鼠精子畸形試驗動物合格證號：NO.0064739。試驗前在動物房適應5d。

實驗環(huán)境：SPF級動物房。實驗動物使用許可證編號：SYXK(粵)2008－0086。實驗期間，室溫21±2℃，相對濕度52% －65%。

2.1.2 儀器

低溫高速離心機，低溫冰箱，恒溫培養(yǎng)箱，潔凈工作臺，生物顯微鏡，電子天平，解培器械等。

2.1.3 主要試劑

試驗樣品：市售戊二醛溶液(汕頭市西隴化工廠有限公司生產(chǎn)，濃度為25%，分析純);絲裂霉素、1.8－二羥蒽醌：武漢馳飛精細化學科技發(fā)展有限公司;2－氨基芴：上海金穗生物科技有限公司;疊氮鈉：上海天齊生物科技有限公司;地可松(Deon4－dimethylaminobenzenediazosulfonic*acid sodium：蘇州亞科化學試劑股份有限公司;環(huán)磷酰胺：山西普德藥業(yè)有限公司;Wright－Giemsa染液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

2.2 方法

2.2.1 試驗溶液配制

Ames試驗：在無菌操作條件下，試驗樣品用蒸餾水稀釋配制成戊二醛含量為20mg/mL溶液作為最高劑量組(即2000μg/皿)，其他劑量組分別以此為母液進行稀釋;小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗的高劑量組分別為125mg/kgbw(約相當于1/2的經(jīng)口LD50的劑量)和83mg/kg體重(約相當于1/3的經(jīng)口LD50的劑量)。其他劑量組分別用高劑量組稀釋而成。

2.2.2 Ames試驗［3］

采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型 TA97、TA98、TA100、TA102 四株試驗菌株進行試驗。設(shè)2000、400、80、16μg/皿 4 個劑量組和陰性對照組、陽性對照組。采用平板摻入法，加S9與不加S9進行試驗，菌株性狀及S9活性經(jīng)鑒定符合要求。37℃培養(yǎng)48h，計數(shù)每皿菌落數(shù)，如受試物的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并有劑量－反應關(guān)系者定為陽性。整個實驗在相同試驗條件下進行2次獨立試驗。

2.2.3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗［4］

取體重25－30 g SPF級昆明種小鼠50只，隨機分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、陰性對照組和陽性對照組，每組10只，雌雄各半。用蒸餾水作為陰性對照組受試物;陽性對照組給予環(huán)磷酰胺，劑量為40mg/kgbw。試驗組高、中、低3個劑量組的劑量分別為125、50、5mg/kgbw;采用30h給受試物法，經(jīng)口灌胃方式 2次，染毒間隔 24h，每次按0.2mL/10g體重的量給予。在第2次染毒后6h，處死各組動物。每個小鼠取2根股骨，用小牛血清常規(guī)涂片，晾干后，在無水甲醇液中固定8min，第2天在Wright－Giemsa染液中染4min。在油鏡下閱片，每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細胞(PCE)，計算微核發(fā)生率;計數(shù)200個嗜多染紅細胞，計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比例(PCE/NCE)。

2.2.4 小鼠精子畸形試驗［5］

SPF級昆明種雄性小鼠30只，體重25－30g，隨機分為5組，每組6只。陽性對照組給予50mg/kgbw劑量的環(huán)磷酰胺;陰性對照組給予蒸餾水。3個試驗組給樣劑量分別為83、13、1.3mg/kgbw。按每只每天0.2mL/10g體重的量經(jīng)口給予，連續(xù)5 d，各組動物正常飼養(yǎng)30 d。在首次灌胃后的第35天處死動物。取出二側(cè)副睪，放入有適量(約0.5mL)生理鹽水的小燒杯中。用眼科剪將副睪縱向剪1－2刀，靜止約4 min，輕輕搖動。吸液涂片。空氣干燥后，用甲醇固定約7 min，干燥，用1.5%伊紅染色1 h，用水輕沖，干燥。每只動物計數(shù)1000個結(jié)構(gòu)完整的精子，計算畸變精子發(fā)生率。

3 實驗結(jié)果

3.1 Ames試驗

在細菌回復突變試驗中，最高濃度應能顯示明顯的毒性，見回復突變數(shù)減少、背景菌斑減少或消失。對 TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗菌株，加與不加S9，樣品各劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，亦無劑量—反應關(guān)系。2次獨立試驗的結(jié)果見表1、表2。

表1 第1次鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗結(jié)果()

表1 第1次鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗結(jié)果()

TA97TA98TA100TA102－S9 +S9受試物組 2000 124.32.1 120.33.2 37.01.0 34.01.0 128.0組別 劑 量(μg/皿)－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S93.6 129.04.4 260.32.5 260.32.5400 119.73.1 125.75.5 35.72.1 37.02.6 127.73.5 128.02.0 256.32.5 256.32.580 122.33.1 126.02.0 37.04.6 32.32.3 126.72.1 127.34.9 261.03.0 261.03.0

(續(xù)表)

表2 第2次鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗結(jié)果()

表2 第2次鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動物微粒體酶試驗結(jié)果()

TA97TA98TA100TA102－S9 +S9受試物組 2000 124.72.4 124.62.6 37.02.1 37.03.8 128.3組別 劑 量(μg/皿)－S9 +S9－S9 +S9－S9 +S92.5 125.35.9 258.03.8 256.33.3400 126.74.7 127.35.4 36.32.5 35.42.6 126.74.3 128.33.8 263.03.4 25.33.880 129.72.5 124.02.3 36.72.3 35.32.8 128.92.6 128.03.5 25842.5 258.03.516 122.32.6 124.34.3 36.43.2 36.32.3 126.32.7 126.33.2 260.4.6 257.35.2陰性對照 － 128.33.9 126.32.5 34.42.3 34.32.8 127.02.6 134.83.2 2787.6 263.03.3陽性對照 見注 1238164 1296306 2349363 1363216 1497228 1793301 1260156 1257156

3.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗

一般癥狀：灌胃約30min后，高劑量組受試動物出現(xiàn)以下中毒癥狀：呆滯、運動失調(diào)、豎毛、皮膚略紫紺、肢體癱軟、呼吸困難等，但至處死動物前，各組動物未見死亡。

鏡檢：在高劑量組鏡檢可見細胞溶解、破裂現(xiàn)象;樣品各劑量組微核率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而各劑量組和陰性對照組微核率顯著低于環(huán)磷酰胺組(P＜0.01)，各組PCE/NCE比值均在正常范圍內(nèi)，見表3。

表3 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發(fā)生率和PCE/NCE比值

3.3 小鼠精子畸形試驗

一般癥狀：在給予受試物期間，高劑量組和陽性對照組受試動物可見以下中毒癥狀：呆滯、運動失調(diào)、豎毛、皮膚略紫紺、肢體癱軟等癥狀，停止染毒后1－2d逐漸恢復。在實驗的第35天處死動物前，各組動物均未見死亡和中毒癥狀，生長發(fā)育狀況和體重無明顯區(qū)別。

精子鏡檢：陽性對照組畸變率明顯高于陰性對照組和高、中、低劑量組，存在倍量差異，并且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01);受試物高、中、低劑量組畸變率分別與陰性對照組相比無顯著性差異，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05);見表4。

表4 對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

4 討論

Ames試驗、微核試驗、精子畸形試驗是經(jīng)典、常用的檢測化學物質(zhì)遺傳毒性的方法組合［6］。Ames試驗是應用最廣的基因突變檢測方法，鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98檢測移碼突變、TA100、TA102菌株檢測堿基置換和移碼突變，反映基因水平上的遺傳物質(zhì)受損情況。微核試驗、精子畸形試驗反映了體細胞染色體遺傳物質(zhì)受損情況和生殖細胞受損情況。以上3項試驗聯(lián)合檢測，可從體內(nèi)、體外試驗兩方面，全面檢測外來物質(zhì)對原核細胞和真核細胞、生殖細胞與體細胞的遺傳毒性。分別反映了受檢化學物質(zhì)對基因、染色體和生殖細胞的致突變性。

在本實驗中，戊二醛作為一種具有揮發(fā)性和刺激性的化學試劑，在其生產(chǎn)使用過程中可多途徑、低劑量進入人體，Ames試驗、微核試驗、精子畸形試驗的最高劑量分別是 2000μg/皿、125mg/kg體重、83mg/kg體重，可見到抑菌現(xiàn)象或中毒癥狀，說明3個實驗的高劑量組的染毒劑量足夠大。而在此較高劑量水平下，Ames試驗、微核試驗、精子畸形試驗的高、中、低劑量組結(jié)果均為陰性，說明戊二醛沒有遺傳毒性。

［1］李臨生，張京東，張昌輝.戊二醛消毒劑的特點與應用［J］.日用化學工業(yè)，2004，34(6)：385－389.

［2］許崇輝，潘芳，溫巧玲，等.戊二醛急性毒性研究［J］.檢驗檢疫學刊，2012，22(4)：22 －24.

［3］GB/T 21786－2008化學品 細菌回復突變試驗方法［S］.

［4］GB/T 21773－2008化學品體內(nèi)哺乳動物紅細胞微核試驗方法［S］.

［5］GB15193.7－2003小鼠精子畸形試驗［S］.

［6］FDA.Guidance for industy and review staff：Recommended approaches to integration of genetic toxicology study results［S］.2006.