劉天巍，任 麗，楊廣順，孫春玉，王 義，張美萍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是與靶基因同源雙鏈RNA引發(fā)，在動(dòng)植物和真菌中普遍存在序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象[1]。RNA干擾作為一種敲除基因新技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因功能、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究等領(lǐng)域。RNAi最早是在線蟲(chóng)C.elegans上發(fā)現(xiàn)[2]，現(xiàn)已應(yīng)用于真菌、動(dòng)物和植物基因功能分析[3]。在擬南芥中，利用RNAi技術(shù)成功抑制一些參與生理代謝和生長(zhǎng)發(fā)育基因表達(dá)，如AGAMOUS、CLAVATA3 和FAD2 等[4－5]。在煙草[6]、水稻[7]等作物上觀察到雙鏈RNA降低目的基因mRNA表達(dá)水平的現(xiàn)象，Tang等在利用RNAi技術(shù)改善植物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的可行性方面進(jìn)行了探討[8]。

人參皂苷是人參屬植物重要的次生代謝產(chǎn)物，有極廣泛的生理和藥理活性，包括提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗應(yīng)激、抗炎、抗疲勞、增強(qiáng)記憶力、延緩衰老、降血糖、抗氧化等作用。人參皂苷含量較低，限制其開(kāi)發(fā)與利用，因此如何提高其含量已成為研究熱點(diǎn)，深入研究人參皂苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的結(jié)構(gòu)和功能，并利用基因工程手段調(diào)控這些關(guān)鍵酶基因的活性，達(dá)到調(diào)控人參皂苷含量目的，具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。鯊烯環(huán)氧酶（Squalene epoxidase，SE）是一種單加氧酶，是三萜皂苷生物合成途徑中關(guān)鍵酶之一，其基因編碼的酶催化鯊烯生成2，3－氧化鯊烯[9]，鯊烯環(huán)氧酶是皂苷合成途徑過(guò)程中最后一個(gè)通用酶[10]。研究證實(shí)體外誘導(dǎo)增加SE基因的mRNA表達(dá)，三萜生成量隨之增加，降低SE基因的mRNA表達(dá)，三萜合成將受到抑制[11]。

本研究采用RT－PCR技術(shù)克隆得到人參SE基因片段，構(gòu)建對(duì)應(yīng)于SE基因的RNAi高效雙元表達(dá)載體，利用RNA干擾技術(shù)抑制人參鯊烯環(huán)氧酶基因表達(dá)，有助于驗(yàn)證鯊烯環(huán)氧酶基因在三萜皂苷代謝途徑中的重要功能，為以鯊烯環(huán)氧酶基因?yàn)榛A(chǔ)的三萜皂苷合成途徑調(diào)控研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和載體：PUM－T快速克隆試劑盒（購(gòu)自北京百泰克公司）。pMD18－T載體（購(gòu)自TaRaKa公司）。大腸桿菌DH5α、pMHZ111載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑：膠回收試劑盒購(gòu)于愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司，引物均由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

植物材料：供試材料為5年生人參嫩葉，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞工程研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 人參葉片總RNA的提取及RT－PCR反應(yīng)

以5年生人參葉片為材料，采用改良的Trizol法（Invitrogen公司）提取總RNA，cDNA合成參照MBI公司RevertAidTMfirst strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。

1.2.2SE基因正義、反義片段的克隆與測(cè)序

根據(jù)SE基因及其保守區(qū)的基因信息利用軟件primer 5.0設(shè)計(jì)人參SE干擾片段引物，并且根據(jù)pMHZ111表達(dá)載體的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在正義片段S引物兩端分別加上XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，反義片段A引物兩端分別加上XhoⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。引物序列如下：

正義片段S：

SE－S1： 5'TGCTCTAGACACTTTTATTAGGGG ATGC 3'

SE－S2： 5'CGCGGATCCAAGAAGTGGAGAAA TAGGC 3'

反義片段A:

SE－A1：5'CCGCTCGAGCACTTTTATTAGGGG ATGC 3'

SE－A2：5'CCCAAGCTTAAGAAGTGGAGAAA TAGGC 3'

采用25 μL反應(yīng)體系，PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，循環(huán)35次，72℃后延伸7 min。將SE基因正義、反義片段的PCR產(chǎn)物純化后分別連接T載體，將PCR驗(yàn)證正確的陽(yáng)性重組子進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取。選取PCR鑒定呈陽(yáng)性的克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證并測(cè)序。分別將測(cè)序正確的重組子命名為pMD18－T－S和pMD18－T－A。

1.2.3SE基因RNAi雙元表達(dá)載體pMHZ111－SE的構(gòu)建

由圖1可知，pMHZ111載體具有多個(gè)酶切位點(diǎn)，利于干擾片段的連接，具有多種啟動(dòng)子。載體可作為普通RNAi表達(dá)載體使用，亦可作為雙元干擾表達(dá)載體，在單子葉植物及雙子葉植物中均可以表達(dá)。

利用XbaⅠ和BamHⅠ分別對(duì)測(cè)序正確的重組克隆質(zhì)粒pMD18－T－S和pMHZ111進(jìn)行正義片段雙酶切，切膠回收，用回收的片段作正義連接，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。選取長(zhǎng)出的單菌落做PCR檢測(cè)，檢測(cè)出的陽(yáng)性克隆搖菌提取質(zhì)粒，將提取出的質(zhì)粒和測(cè)序正確的pMD18－T－A進(jìn)行XhoⅠ和HindⅢ反義片段雙酶切，切膠回收，用回收的片段做反義連接，獲得RNAi雙元表達(dá)載體pMHZ111－SE。將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將已轉(zhuǎn)化大腸桿菌的RNAi表達(dá)載體pMHZ111－SE進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增鑒定和酶切鑒定。

1.2.4 RNAi植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101

運(yùn)用熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定正確的轉(zhuǎn)化子在抗性培養(yǎng)基中繼代15代，進(jìn)行pMHZ111－SE在農(nóng)桿菌中的遺傳穩(wěn)定性分析。

1.2.5 人參愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化人參愈傷組織，23℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，再轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基。一周后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，待人參愈傷組織穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)，用繼代培養(yǎng)基繼代。

1.2.6 抗性愈傷組織的PCR檢測(cè)

圖1 RNA干擾雙元表達(dá)載體pMHZ111Fig.1 RNAi binary plant expression vector pMHZ111

將篩選出的人參愈傷組織采用CTAB法提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別選用引物S1、P1和A1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.7 人參皂苷的提取

將PCR鑒定正確的人參愈傷組織采用索式技術(shù)提取人參皂苷[12]。

1.2.8 皂苷含量的測(cè)定

運(yùn)用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法測(cè)定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因人參愈傷組織中6種主要單體皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Re的含量（人參單體皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Re對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所），比較分析單體皂苷含量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 正義片段SE-S和反義片段SE-A的克隆

以cDNA為模板，用引物SE－S1/SE－S2對(duì)正義片段S進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用SE－A1/SE－A2對(duì)反義片段A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶與預(yù)期364 bp的片段大小一致，初步表明已獲得這兩個(gè)干擾片段（見(jiàn)圖2）。

2.2 重組質(zhì)粒pMHZ111-SE的酶切鑒定

首先對(duì)重組質(zhì)粒pMHZ111－SE進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒DNA，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMHZ111－SE用XbaⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶酶切，切出大小364 bp的正義片段及其余載體部分，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMHZ111－SE用XhoⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶酶切，切出大小364 bp的反義片段及其余載體部分（見(jiàn)圖3）。以上表明目的片段已和pMHZ111載體連接。

圖2 正反義片段的PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR product of sense and anti-sense fragment

2.3 抗性愈傷組織的PCR檢測(cè)

根據(jù)pMHZ111中發(fā)夾內(nèi)含子的序列信息設(shè)計(jì)PDK Intron的上游引物P1和下游引物P2，序如下：P1：5'AGCGAATTCTAGTATAAAATAGTTAA GTG 3'，P2：5'ATGGAATTCCAATCCAAAT GTAA GATC 3'采用CTAB法提取抗性愈傷組織DNA，以P1、P2為引物，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖4所示，由圖4可見(jiàn)，得到大小為1 400 bp條帶，符合內(nèi)含子加上正義片段和反義片段長(zhǎng)度，說(shuō)明干擾載體pMHZ111－SE上目標(biāo)片段已轉(zhuǎn)入人參愈傷中。

2.4 轉(zhuǎn)基因愈傷組織皂苷含量的測(cè)定

圖3 重組質(zhì)粒pMHZ111-SE酶切產(chǎn)物Fig.3 Recombinant plasmid digested product of pMHZ111-SE

采用索氏提取技術(shù)提取樣品液，并用HPLC法測(cè)定陰性對(duì)照及轉(zhuǎn)化后人參愈傷組織中6種主要單體皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Re的含量。結(jié)果見(jiàn)圖5。表明，經(jīng)RNAi干擾后，Rg1、Re、Rc含量均有大幅度下降，其他3種皂苷含量變化不明顯。人參皂苷生物合成過(guò)程不僅僅是由單基因控制，而是由多個(gè)基因控制，以及相關(guān)酶基因相互協(xié)同作用的結(jié)果。只抑制某一單基因的表達(dá)，對(duì)次生代謝終產(chǎn)物含量不會(huì)有顯著影響；另外受轉(zhuǎn)化材料限制，轉(zhuǎn)化的人參愈傷組織較松散，不易除菌，有可能存在部分假陽(yáng)性。

圖5 人參愈傷組織中皂苷含量的變化Fig.5 Changes of saponin content of ginseng callus

3 討論與結(jié)論

在通常情況下，人參根中總皂苷含量只占其干重5%[13]，用傳統(tǒng)方法從人參根中獲得人參皂苷成本較高。因而針對(duì)皂苷生物合成途徑限速酶調(diào)控機(jī)制，在分子水平上實(shí)現(xiàn)皂苷合成的定向調(diào)節(jié)是提高人參皂苷合成能力的有效手段。Lee等構(gòu)建人參SQS正義植物表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)化人參，結(jié)果表明達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型三萜皂苷含量比對(duì)照提高1.3～3.0倍[14]。

目前研究基因功能方法主要包括T－DNA插入突變、反義抑制、轉(zhuǎn)座子插入突變等[15]，傳統(tǒng)阻斷基因表達(dá)方法主要是反義RNA技術(shù)，反義RNA是在啟動(dòng)子下游連接一個(gè)反向的基因片段，從而使目的基因表達(dá)率降低，一般達(dá)85%。而本試驗(yàn)采用RNAi方法，與傳統(tǒng)反義RNA方法相比，RNAi技術(shù)抑制基因表達(dá)效率更高，可達(dá)95%。

在構(gòu)建RNAi載體時(shí)，要在啟動(dòng)子下游插入正向與反向的干擾片段，必須在兩者之間有一段長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)膬?nèi)含子序列，以便在轉(zhuǎn)入人參愈傷組織后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成約22 bp siRNA，由siRNA干擾SE基因表達(dá)，pMHZ111在啟動(dòng)子下游恰好有一個(gè)700 bp的內(nèi)含子序列，符合構(gòu)建干擾載體條件。

SE在人參皂苷合成的次級(jí)代謝中，主要作用是在角鯊烯的C=C雙鍵中插入一個(gè)O原子使其成為環(huán)氧化物2，3－氧化角鯊烯，經(jīng)一系列催化反應(yīng)，形成包括人參皂苷在內(nèi)的各種三萜類次生代謝產(chǎn)物。本研究基于人參皂苷生物合成途徑，通過(guò)RNAi技術(shù)，抑制人參愈傷中鯊烯環(huán)氧酶基因的表達(dá)，結(jié)果導(dǎo)致皂苷合成減弱。表明調(diào)控SE基因可調(diào)控皂苷合成，即SE是人參皂苷合成途徑關(guān)鍵酶。利用生物技術(shù)手段調(diào)控這些關(guān)鍵酶基因活性，提高人參中皂苷含量，為最終提高人參皂苷生物合成量提供重要理論依據(jù)，具有廣闊應(yīng)用前景。

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