馮世超，趙宏偉，王敬國(guó)，劉化龍，趙 雪，鄒德堂*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所，哈爾濱 150038；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，哈爾濱 150030）

在我國(guó)現(xiàn)有耕地中，至少有800萬(wàn)hm2土地由于不當(dāng)灌溉和施肥，導(dǎo)致土壤鹽分累積而形成鹽漬化[1]，成為限制我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展重要因素。水稻是我國(guó)主要的糧食作物之一，作為粳稻主產(chǎn)區(qū)的黑龍江省，鹽堿地面積達(dá)40萬(wàn)hm2。其中，黑龍江省西部地區(qū)有鹽堿土近66.7萬(wàn)hm2，主要分布在大慶及齊齊哈爾南部地區(qū)，其中含鹽量超過(guò)1%的鹽土和堿土超過(guò)10萬(wàn)hm2[2]。選育耐鹽水稻品種以適應(yīng)土地鹽堿化尤為重要。

與傳統(tǒng)育種相比，利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合QTL分析方法尋找與水稻耐鹽性緊密連鎖的分子標(biāo)記，并用于分子標(biāo)記輔助選育耐鹽品種，是加快育種進(jìn)程的有效途徑，同時(shí)為抗性基因的挖掘和圖位克隆奠定基礎(chǔ)。水稻耐鹽性是多基因控制的數(shù)量性狀，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用不同群體定位了許多與耐鹽性相關(guān)的QTLs。龔繼明等用秈稻窄葉青8號(hào)（ZYQ8）和粳稻京系17（JX17）為親本的DH群體對(duì)水稻耐鹽性進(jìn)行QTL定位，以植株存活時(shí)間為指標(biāo)，在1號(hào)染色體RG612和C131標(biāo)記之間定位一個(gè)主效QTL－Std，以及其他7個(gè)微效QTL，貢獻(xiàn)率10.2%～38.4%[3]。Lin等利用遺傳差異較大的耐鹽品種Nona Bokra和感鹽品種Koshihikari所構(gòu)建的F2∶3群體，定位到3個(gè)影響鹽脅迫幼苗存活天數(shù)的QTL，貢獻(xiàn)率為13.9%～18.0%，并在第7和第1染色體上檢測(cè)到影響莖Na+和K+濃度的主效QTL，表型貢獻(xiàn)率分別達(dá)48.5%、40.1%、40.6%和41.7%[4]。在以往研究中，QTL定位結(jié)果受群體數(shù)量及圖譜標(biāo)記密度限制，得到的QTL精度差、置信區(qū)間大，很難估計(jì)QTL的準(zhǔn)確位置及其貢獻(xiàn)率大小，制約QTL在育種工作中的進(jìn)一步應(yīng)用。Goffinet和Gerber提出的Bioercator應(yīng)用程序可將前人研究獲得的QTL映射到高密度參考圖譜上，并通過(guò)元分析方法確定真實(shí)性QTL和縮小置信區(qū)間[5]。李雪華等對(duì)不同研究者在干旱條件下定位到的與玉米抗旱性相關(guān)的181個(gè)QTL進(jìn)行整合分析，從中發(fā)掘出15個(gè)耐旱“通用QTL”[6]。吳瓊等整合控制大豆生育期的98個(gè)QTLs，發(fā)現(xiàn)9個(gè)真實(shí)QTLs和相應(yīng)的連鎖標(biāo)記[7]。

本研究對(duì)已經(jīng)定位的水稻耐鹽性QTLs進(jìn)行整合，以期發(fā)現(xiàn)真實(shí)QTLs，為水稻耐鹽性遺傳機(jī)制研究、耐鹽分子輔助育種及耐鹽基因挖掘提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻耐鹽性QTLs數(shù)據(jù)的選擇、收集和整理

從www.gramene.org網(wǎng)站和已發(fā)表的文獻(xiàn)收集水稻耐鹽性QTLs的定位信息。收集和整理包括作圖群體信息（群體大小、群體類型、群體名稱和作圖函數(shù)），性狀信息，QTL信息（QTL名稱、染色體位置、LOD值、貢獻(xiàn)率、置信區(qū)間和加性效應(yīng)）以及遺傳圖譜信息（標(biāo)記名稱及遺傳距離）。如果某些QTL信息沒(méi)有給出置信區(qū)間，可以根據(jù)文獻(xiàn)[8]公式推斷其95%的置信區(qū)間（見(jiàn)表1）。

表1 已報(bào)道的水稻耐鹽性QTLsTable 1 Reported rice QTLs conferring salt tolerance

式中，CI是QTL的置信區(qū)間，N是作圖群體的大小，R2是QTL貢獻(xiàn)率。公式（1）適用回交和F2群體，公式（2）適用RILs群體。

1.2 水稻耐鹽性QTLs的映射

計(jì)算QTL在參考圖譜上的坐標(biāo)值的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)是齊序函數(shù)（Homothetic function）[22]，計(jì)算共有標(biāo)記間的距離，將原始圖譜上的QTL按比例映射到參考圖譜上[23]，即映射（Projection）。Biomercator 2.1軟件通過(guò)嚴(yán)格識(shí)別QTL兩側(cè)的標(biāo)記名實(shí)現(xiàn)映射，如果左右標(biāo)記其中之一不能映射，那么QTL將被舍棄。

不同QTL定位研究所用的作圖群體和分子標(biāo)記存在差異，構(gòu)建的遺傳圖譜之間相同標(biāo)記較少，在進(jìn)行QTL映射時(shí)需選擇一個(gè)高密度分子連鎖圖譜來(lái)作參考圖譜。本研究所用參考圖譜是高密度遺傳連鎖圖譜Cornell 2001，具有較高的可信度，而且與原始圖譜之間有大量共同標(biāo)記，便于圖譜整合及QTL映射的實(shí)現(xiàn)。

1.3 水稻耐鹽QTLs的元分析

元分析（又稱作整合分析、統(tǒng)合分析、薈萃分析）是將不同研究結(jié)果匯總成原始數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析的統(tǒng)計(jì)方法，它可以將不同實(shí)驗(yàn)相近基因組區(qū)域檢測(cè)到的QTL進(jìn)行聚類。2000年，Goffinet和Gerber開(kāi)發(fā)了元分析的算法[24]。具體過(guò)程：根據(jù)n個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中QTLs，同一區(qū)域一致性QTLs由1－、2－、3－、4－和N－QTLs 5種模型模擬決定，即以最小的AIC值來(lái)確定真實(shí)性QTL。每種模型都是根據(jù)極大似然方法并通過(guò)高斯定理給出QTLs在染色體上的最大可能排列。模型中，一致性QTL位點(diǎn)取決于QTL最大可能分布的平均值，QTL一致性位點(diǎn)的方差由下面公式估計(jì)：

AIC值取決于模擬過(guò)程，所以它的優(yōu)化使用需滿足以下條件：QTL嚴(yán)格來(lái)源于獨(dú)立實(shí)驗(yàn)；QTL數(shù)量10～40個(gè)；QTL在染色體上的覆蓋區(qū)域不超過(guò)200 cM。若處理較大的染色體或一組較大的QTLs時(shí)，應(yīng)把染色體片段分割，在每個(gè)小片段上重復(fù)進(jìn)行元分析[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽性QTLs在水稻染色體上的分布

在BioMercator 2.1軟件tools－maps projection選項(xiàng)下，實(shí)現(xiàn)水稻耐鹽QTL的映射。映射結(jié)果中，有7個(gè)群體定位的119個(gè)QTLs得到映射，構(gòu)建一張水稻耐鹽QTL的一致性圖譜。從圖譜可以發(fā)現(xiàn)，耐鹽QTL在染色體上呈不均勻分布，各條染色體上都有和耐鹽相關(guān)的QTL；第1、2、3、4、5、6、8、9、11、12條染色體上分布的QTLs較多，第7和第10條染色體上分布較少；其中，第5、7、8、9、10、12條染色體上QTLs成簇分布，其他染色體上則散在分布，整合后的部分QTLs分布見(jiàn)圖1。

圖1 部分耐鹽QTLs在8、9、10號(hào)染色體上的分布Fig.1 Distribution of salt tolerance QTLs in 8,9 and 10 chromosome

2.2 耐鹽性QTLs的元分析

在BioMercator 2.1軟件tools－Meta－analysis選項(xiàng)下，進(jìn)行耐鹽QTL的元分析。結(jié)果以每次元分析中AIC值最小的模型為準(zhǔn)來(lái)確定真實(shí)QTL。因?yàn)樵治鲋挥性诔纱貐^(qū)中產(chǎn)生才是有意義，所以在實(shí)際操作中忽略散在分布QTL位點(diǎn)產(chǎn)生的結(jié)果。

由表2可知，共有14個(gè)真實(shí)QTL被發(fā)現(xiàn)，第8和第9兩條染色體上真實(shí)QTL較多。其中，在第8條染色體上，位于99.32 cM處，圖距3.46 cM的QTL被發(fā)現(xiàn)，其標(biāo)記區(qū)間為RM22998－RM23175，置信區(qū)間97.58～101.06。在第9條染色體上，位于46.1 cM處，圖距2.78 cM的QTL被發(fā)現(xiàn)，其標(biāo)記區(qū)間為RM296－RM3912，置信區(qū)間44.71～47.49。除這兩個(gè)QTLs外，在第9條染色體上還有3個(gè)圖距小于5 cM的真實(shí)QTL，分別位于63.93、81.89、85.58 cM處，標(biāo)記區(qū)間和置信區(qū)間分別是RM409－RM 24271、RM410－RM160、RM6543－RM6491 和 63.65～64.21、81.43～82.35、84.32～86.64，第 7 條染色體有一個(gè)圖距小于5 cM的真實(shí)QTL，位于144.2 cM處，標(biāo)記區(qū)間和置信區(qū)間分別為RM248－RM420和144.1～144.5。

將元分析得到的真實(shí)QTL與原始QTL信息相比較表明，元分析可以明顯縮小QTL的置信區(qū)間，如圖2所示。

表2 水稻耐鹽QTL的元分析Table 2 Meta-analysis of salt tolerance QTLs in rice

圖2 8、9、10號(hào)染色體上耐鹽QTL的元分析Fig.2 Meta-analysis of salt tolerance QTLs on 8,9 and 10 chromosome

位于第8染色體上110.09 cM處的真實(shí)QTL與原始QTL位置十分接近，但其圖距從原來(lái)的24.5 cM縮小到8.0 cM；位于第9染色體上46.1 cM處得真實(shí)QTL圖距為2.78 cM，比原始QTL圖距13.60 cM縮小10.82 cM；位于第10染色體上53.72 cM處真實(shí)QTL與原始QTL位置相同，但其圖距從原來(lái)的12.2 cM降到5.63 cM，其他染色體上的QTLs置信區(qū)間有不同程度的縮小。

3 討論

3.1 圖譜整合和元分析方法的應(yīng)用

圖譜整合把分子連鎖圖與經(jīng)典圖譜和基因組圖譜進(jìn)一步結(jié)合。在高密度圖譜構(gòu)建的基礎(chǔ)上，通過(guò)元分析可以進(jìn)一步找到真實(shí)QTL及其標(biāo)記區(qū)間，因此圖譜整合是發(fā)掘候選基因的新途徑。尤莉等將ESTs電子定位結(jié)果與玉米耐鹽性QTLs的圖譜整合，經(jīng)驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)3個(gè)重要耐鹽性候選基因[26]。元分析方法在其他研究中已早有應(yīng)用，Guo等對(duì)抗大豆胞囊線蟲(chóng)QTL進(jìn)行元分析，并得到“真實(shí)QTL”及其連鎖標(biāo)記[27]。大多數(shù)QTL定位重要性狀基因多呈數(shù)量性狀遺傳，受遺傳背景、群體大小、基因與環(huán)境互作、統(tǒng)計(jì)方法等因素影響很大，單一的一次定位中難以真實(shí)評(píng)價(jià)每個(gè)QTL所能解釋的遺傳變異，標(biāo)記的有效性較低。采用元分析方法，在整合QTL的基礎(chǔ)上，建立數(shù)學(xué)模型，可以縮小置信區(qū)間，具有較高的可信度，提高QTL定位的準(zhǔn)確度和有效性，可克服傳統(tǒng)QTL分析結(jié)果的局限性，為更好詮釋QTL奠定基礎(chǔ)[7]。

通常高密度遺傳圖譜是精細(xì)定位QTL的前提，由于作圖群體的規(guī)模過(guò)小等原因很難獲得較高密度的圖譜，造成已有圖譜分析率較低。因此，為保證元分析的準(zhǔn)確性，必須采用高密度的整合圖譜。本研究所用的參考圖譜是高密度遺傳連鎖圖譜Cornell 2001，具有較高可信度，與原始圖譜之間有大量共同標(biāo)記保證QTL位點(diǎn)的進(jìn)一步分析。

3.2 耐鹽性QTL圖譜整合對(duì)MAS實(shí)踐的意義

隨著數(shù)量遺傳學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳行為研究成為可能。借助分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法可確定目標(biāo)性狀在染色體上的位置和效應(yīng)。國(guó)內(nèi)外研究者通過(guò)構(gòu)建各種類型的群體定位許多QTL的遺傳連鎖圖譜，將控制某一性狀的QTL整合到一張相對(duì)飽和的遺傳圖譜上，不僅從整體把握該性狀在染色體上的分布特征，而且通過(guò)元分析可發(fā)現(xiàn)真實(shí)QTL及其標(biāo)記區(qū)間[5]。

本研究將已公開(kāi)發(fā)表的水稻苗期耐冷QTL進(jìn)行收集和整理，通過(guò)映射和元分析建立水稻耐鹽一致性圖譜，所發(fā)現(xiàn)的真實(shí)QTL標(biāo)記區(qū)間與原區(qū)間相比都明顯縮小。如第8染色體110.09 cM處發(fā)現(xiàn)的真實(shí)QTL與原始QTL相比其圖距從原來(lái)的24.5 cM縮小到8.0 cM；位于第9染色體上46.1 cM處真實(shí)QTL比原始QTL圖距縮小10.82 cM。這些真實(shí)QTL及其標(biāo)記區(qū)間為水稻耐鹽分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

3.3 圖譜整合的局限性

圖譜整合在快速整合QTL有效縮小置信區(qū)間的同時(shí)，也有一定的局限。圖譜整合需要應(yīng)用大量圖譜，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)定位的QTL數(shù)量及參考圖譜上標(biāo)記致密程度都影響映射的效果，所以在整合過(guò)程中存在真實(shí)QTL丟失現(xiàn)象，在本研究中第3、第4、第11條染色體上QTLs散布于染色體上，不能確定有無(wú)真實(shí)QTL。隨著QTL定位數(shù)量增加和遺傳圖譜逐漸飽和，真實(shí)QTL丟失現(xiàn)象會(huì)得到控制[28]。

不同標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜整合，實(shí)質(zhì)上就是不同標(biāo)記的相互轉(zhuǎn)換與結(jié)合?？煽紤]啟用一些能對(duì)DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的標(biāo)記（如：SCAR、STS、EST等），通過(guò)對(duì)標(biāo)記片段進(jìn)行克隆和雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)實(shí)現(xiàn)片段的轉(zhuǎn)換，加強(qiáng)不同圖譜之間的聯(lián)系與整合[29]。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)手段，收集整理來(lái)自15個(gè)作圖群體共263個(gè)與水稻耐鹽性相關(guān)的QTLs信息。通過(guò)Biomercator2.1和共有標(biāo)記映射，將QTLs整合到參考圖譜Cornell 2001上，并通過(guò)元分析方法計(jì)算真實(shí)QTLs及其臨近標(biāo)記。得到以下結(jié)論，構(gòu)建一張水稻耐鹽QTL的一致性圖譜。水稻耐鹽QTL在第5、7、8、9、10、12條染色體上QTLs成簇分布，其他染色體上則散在或缺失分布。元分析共發(fā)現(xiàn)14個(gè)真實(shí)QTL，其中6個(gè)圖距小于5 cM的真實(shí)QTLs分別位于第7、8、9條染色體上；這些一致性位點(diǎn)可用于耐鹽水稻品種的分子輔助選育及耐鹽基因的圖位克隆。

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