楊海玉，查 杰，馬智龍

(泰州市疾病預防控制中心，江蘇泰州225300)

手足口病是5歲以下兒童中發(fā)生的常見傳染病，但目前尚無針對手足口病的預防性疫苗或治療性藥物?？滤_奇A16(CoxA16)病毒是引起兒童手足口病的重要病原體，其地方株的分離是對本病進行診斷和防治的基礎，可以為我國對CoxA16的研究、毒株的鑒定提供參考和依據［1］。細胞培養(yǎng)是分離病毒的傳統(tǒng)可靠方法，50%組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50法)指能在半數細胞培養(yǎng)板孔或試管內引起細胞病變(CPE)的病毒量，已被用于測定許多種病毒的滴度，與其他傳統(tǒng)方法相比，具有速度較快、結果可重復、更穩(wěn)定的優(yōu)點，且能間接反映病毒的感染力。2012年9～12月，本研究通過觀察MRC-5、Vero、Hep-2及RD細胞在相同條件下感染CoxA16后的TCID50，比較其對CoxA16的敏感性?，F報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 Vero、MRC-5細胞由中科院上海細胞庫提供，RD、Hep-2細胞由江蘇省疾控中心流感室提供，均由本實驗室穩(wěn)定傳代后保存。CoxA16病毒為泰州市2012年手足口病監(jiān)測臨床樣本中分離，由Vero細胞傳代擴增。隨機選擇3株用于實驗，編號為 TZCoxA16-001、TZCoxA16-002、TZCoxA16-003。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗和EDTA-胰酶等為 Gibco產品，其他試劑均為國產分析純。

1．2 方法

1．2．1 細胞傳代培養(yǎng) MRC-5、Vero、Hep-2及 RD細胞分別培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2、飽和濕度傳代，分數個T25細胞瓶。待細胞長成單片80%以上時，換培養(yǎng)液1次，總體積為6 mL。

1．2．2 敏感性檢測 上述4種細胞經消化液消化后，800 r/min離心3 min，加10 mL培養(yǎng)液重新懸浮，吹打均勻，用排槍吸100μL加入96孔培養(yǎng)板，每加1次，剩下的細胞液要重新吹打均勻。細胞加完后，上下左右混合均勻，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。棄去培養(yǎng)液，用D-hanks液清洗2遍。將3株CoxA16病毒毒株用病毒生長液分別作 10 倍系列稀釋，取 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8共 8 個稀釋度，每個稀釋度取0．1 mL 分別接種于長滿單層的 MRC-5、Vero、Hep-2及RD細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，每個稀釋度接種10孔，另設16孔只接種稀釋液作為空白對照，0．1 mL/孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120 h，每12 h觀察各孔CPE情況，出現CPE為感染，即細胞圓縮、折光性增強、細胞核固縮、碎片增多，胞體逐漸空泡化直至破裂。見插頁Ⅲ圖4。及時記錄細胞病變孔數，直到對照細胞老化脫落為止，取3株毒株培養(yǎng)板的平均值?！?”表示25%以內細胞出現CPE;“++”表示25% ～50%細胞出現CPE;“+++”表示50% ～75%細胞出現 CPE;“－”表示無CPE;“/”表示培養(yǎng)終止。按 Reed-Muench 法［2，3］計算各細胞培養(yǎng)96、108、120 h的TCID50。

2 結果

2．1 4種細胞接種后CoxA16病毒CPE情況 見表1。

表1 4種細胞接種CoxA16病毒后CPE情況

2．2 4種細胞不同培養(yǎng)時間的TCID50 見表2。

表2 4種細胞不同培養(yǎng)時間的TCID50

3 討論

自2008年以來，我國兒童中手足口病流行趨勢越來越嚴重。僅2010年國家衛(wèi)生統(tǒng)計數據顯示，我國內地共發(fā)生1 774 669例手足口病病例，造成905例死亡和超過2萬例重癥。CoxA16和人腸道病毒71型(EV71)是引起手足口病的主要病原體［4］。CoxA16病毒屬于小核糖核酸(RNA)病毒科，腸道病毒屬，可致人類多種疾病。自1948年從脊髓灰質炎患兒糞便中分離出該病毒以來，已在全世界引起多次爆發(fā)和流行，受到人們的廣泛關注［5，6］。在CoxA16流行期間，雖然可通過血清中和試驗和核酸擴增測序等手段進行鑒定分型，但病毒分離培養(yǎng)仍然是十分實用和可靠的診斷辦法［7］。

分離腸道病毒所選用的細胞系一般都為人源或猴源細胞［8］，本研究根據以往實驗經驗結合本實驗室細胞庫儲存，選擇了MRC-5、Vero、Hep-2及RD 4種細胞，通過幾種細胞可引起CPE的出現時間及TCID50值來綜合比較其對CoxA16的敏感性。結果顯示，Vero和RD細胞在36 h即可出現肉眼可見的細胞病變，Vero和RD細胞96 h的TCID50分別是5．45、2．61。這提示 Vero細胞敏感性最好，病毒產量也最高，在感染后4～5 d可收獲;而RD細胞出現細胞病變最快，一般在2～3 d，但病毒滴度不高。這和手足口病預防控制指南(2009版)中描述的RD細胞培養(yǎng)CoxA16病毒需要盲傳一代［9］的說法一致，也可能和本實驗室存儲的RD細胞代次較低，敏感性下降有關。Hep-2細胞也能形成穩(wěn)定的細胞病變，可作為CoxA16分離培養(yǎng)的可選細胞;MRC-5由于在體外傳代數有限，且培養(yǎng)周期較長，故在實驗室應用受到一定限制［10］。

本研究證明，4種細胞對CoxA16病毒的敏感性由高到低依次為 Vero、RD、Hep-2、MRC-5。因此，Vero細胞可作為當前本地區(qū)CoxA16病毒分離的首選細胞，為進一步研究提供了技術儲備，但本研究是用CoxA16病毒毒株稀釋后模擬樣品進行實驗，進一步的結論還需要大量不同時期樣品的驗證。

［1］李蘭娟．手足口?。跰］．杭州:浙江科學技術出版社，2009:1-61．

［2］中華人民共和國農業(yè)部．中華人民共和國獸用生物制品質量標準(2001年版)［S］．北京:中國農業(yè)科技出版社，2001:303．

［3］Gustafsson RK，Engdahl EE，Fogdell-Hahn A．Development and validation of a Q-PCR based TCID50 method for human herpesvirus 6［J］．Virol J，2012，18(9):311．

［4］楊海玉，馬智龍，查杰．泰州市2009年手足口病病原檢測分析［J］．中國熱帶醫(yī)學，2010，10(1):65-111．

［5］王瀟瀟，郝春生，李懿，等．33株柯薩奇病毒A組16型分離株的全基因序列分析［J］．中國生物制品學雜志，2013，26(3):309-314．

［6］武珊，王文瑞，海巖．柯薩奇病毒A組16型研究進展［J］．疾病監(jiān)測與控制雜志，2011，5(8):478-480．

［7］楊海玉．MDCK、Vero和Hep-2細胞共培養(yǎng)分離甲型H1N1型流感病毒［J］．醫(yī)學動物防制，2011(5):438-439．

［8］David MK，Peter MH．Fields Virology［M］．5th ed．Philadelphia USA:Lippincott Williams and Wilkins，2007:845．

［9］衛(wèi)生部．手足口病預防控制指南(2009版)［R］．衛(wèi)生部公報，2009，12:64．

［10］易波，顧文珍，賀天峰，等．寧波市2010年-2011年重癥手足口病病原學及流行特征分析［J］．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2012，22(7):1670-1673．