張孝杰，陳學(xué)豪，周立紅

(1．集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021;2．集美大學(xué)鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021;3．農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

當前，人類活動不當引起的水體富營養(yǎng)化已成為主要的環(huán)境問題[1]．在我國，太湖、滇池等水域不斷爆發(fā)的藍藻水華，不僅使水體水質(zhì)下降，嚴重危害人體健康，且成為制約我國社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的重要因素．沿岸海域赤潮頻發(fā)也極大影響了漁業(yè)資源的數(shù)量和質(zhì)量．因此，如何有效控制富營養(yǎng)化水體中的藻類爆發(fā)，成為環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點和前沿[2]．

在藻類爆發(fā)的治理方面，抑藻劑的開發(fā)與應(yīng)用被認為是效果顯著和極具潛力的應(yīng)對措施之一[3]．目前，抑藻劑根據(jù)其成分大致可以分為物理性、化學(xué)性及生物化學(xué)性[4]．由于一般化學(xué)抑藻劑對環(huán)境可能帶來二次污染，而且使用劑量通常較大，而物理方法的工作量太大，使得在實際應(yīng)用中受到限制[5]，因此利用生物間的化感作用來抑制有害藻類的生長研究受到關(guān)注[6]．在處理赤潮藻方面，桉木粉[7]、杉木粉[8]、中藥[9]、大蒜[10]、玉米稈[11]、孔石莼[12]以及龍須菜[13]等均被報道具有一定的抑藻效果;在處理藍藻水華方面，大麥稈[14－15]是最早被發(fā)現(xiàn)具有抑藻效果也是目前最為成功的抑藻劑之一．另外，李鋒民等[16]報道了蘆葦化感物質(zhì)EMA對銅綠微囊藻具有抑制作用，何池全等[17]也發(fā)現(xiàn)石菖蒲對水華藻具有凈化作用．其他物質(zhì)如睡蓮[18]、水浮蓮[19]、稻桿[20]、青稞[21]、楓楊[22]等均被發(fā)現(xiàn)可以抑制藍藻．

盡管有了眾多嘗試，但是開發(fā)更多高效低毒的抑藻劑仍是藻類控制領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)．此外，抑藻劑的應(yīng)用方法對于其實際應(yīng)用價值也至關(guān)重要．眾所周知，在一個相對開放的水體中，水流的擴散作用可能使抑藻劑的質(zhì)量濃度迅速降低，以致無法滿足抑藻的需要，或者需要加大用量從而大大增加了處理成本．目前，對于抑藻劑的使用方法主要有浸提液直接潑灑、干品抑藻劑直接投入水體等，這樣雖然可以使得抑藻劑直接與藻類接觸，在某一區(qū)域內(nèi)達到較高抑藻效果，但是也會因為水流的稀釋，造成效果的下降，而加大用量又會對水域微環(huán)境造成破壞．因此，針對如何有效使用抑藻劑的問題進行研究，將有助于使抑藻劑順利投入實際應(yīng)用．固定化技術(shù)是用于食品、制藥行業(yè)的一種成熟技術(shù)，通過將游離細胞或酶定位于限定的空間區(qū)域，并使其保持活性以反復(fù)利用[23]．目前常用的固定化載體為PVA和海藻酸鈉．本文將借鑒這一技術(shù)，將抑藻劑固定于不同的載體上，研究其抑藻效果變化，以探索較好的固定化方法．

1 材料與方法

1.1 試驗藻種

赤潮藻為塔瑪亞歷山大藻 (Alexandrium tamarense DH01株系，縮寫為ATDH01)，藻種取自國家海洋局第三海洋研究所．采用f/2培養(yǎng)液[10]，培養(yǎng)條件為:溫度(20±1)℃，光照3000 lx，光暗比為12 h∶12 h，早、中、晚攪動藻液3次．

淡水水華藻為銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa，縮寫為FACHB-905)，藻種購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫．采用BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)[11]，培養(yǎng)條件為:溫度(25±1)℃，光照3000 lx，光暗比12 h∶12 h，早、中、晚攪動藻液3次．

1.2 抑藻劑的制備

1)茶葉浸提液制備 稱取10 g綠茶葉干品置于100 mL燒杯中，加入50 mL去離子水，煮沸10 min倒出原液，茶渣加水再煮10 min，重復(fù)3次．合并3次液汁并用去離子水定容至50 mL備用．

2)綠茶干粉 用粉碎機將綠茶葉磨成粉備用．

3)純海藻酸鈉小球制備 取1g海藻酸鈉加入50 mL去離子水浸泡1 h，冷卻至室溫，以注射器吸取后懸空 (至少50 cm的距離以保證成球質(zhì)量)滴入2%(體積比)CaC12溶液中，固定1 h后濾出小球以去離子水沖洗3次，靜置2 h，得海藻酸鈉小球，瀝干后稱重．

4)綠茶浸提液海藻酸鈉小球制備 取2g海藻酸鈉加入50 mL去離子水浸泡1h后置于100℃水浴攪拌至溶解為透明膠體，冷卻至室溫再倒入茶葉浸提液50 mL攪勻．同3)方法制球，得茶汁小球，瀝干后稱重，折算出單位質(zhì)量小球含有的綠茶浸提液劑量．再根據(jù)每個質(zhì)量濃度組所需抑藻劑的添加劑量，準備一定量的綠茶浸提液小球．

5)綠茶粉海藻酸鈉小球制備 取2g海藻酸鈉加入100 mL去離子水浸泡1 h后置于100℃水浴并攪拌至溶解為透明膠體，冷卻至室溫再倒入10 g綠茶干粉攪勻．同3)方法制球，得抑藻劑綠茶粉小球，同4)方法稱重、折算及備用．

6)棉片固定化抑藻劑的制備 將PVA高分子膠棉裁剪成小片 (1 cm×1 cm)，5g綠茶葉同1)方法獲得10%的浸提液50 mL．每個質(zhì)量濃度組用5個小棉片為綠茶浸提液載體，將所需劑量抑藻劑滴于棉片上，待完全吸收浸提液后把棉片添加到50 mL藻液中．

1.3 抑藻實驗

取100 mL三角瓶洗凈消毒，ATDH01、FACHB-905搖勻測定初始密度后分別往各三角瓶中加入50 mL ATDH01或FACHB-905．按等對數(shù)間距設(shè)置抑藻劑質(zhì)量濃度梯度，放入載有設(shè)定抑藻劑質(zhì)量濃度的海藻酸鈉小球或棉片．其中海藻酸鈉固定化綠茶抑藻劑的梯度為:CK、0、0.32、0.56、1.00、1.80、3.20 g/L;棉片固定化綠茶抑藻劑的梯度為 CK、0、0.16，0.25，0.40，0.63，1.00，1.60 g/L．質(zhì)量濃度為0的藻液中加入不含綠茶的海藻酸鈉小球或棉片，CK為不加任何東西的藻液，試驗中海藻酸鈉小球和棉片均位于水體下半部分．另將一定質(zhì)量濃度的綠茶粉放置于50 mL ATDH01藻液中，梯度為:0、0.32、0.56、1.00、1.80、3.20 g/L．每組設(shè)3個平行，培養(yǎng)條件同1.1所述．每天搖勻并定時觀察藻細胞狀態(tài)，定時取樣計數(shù)水中藻細胞密度．其中ATDH01藻細胞滴在浮游生物計數(shù)板上于解剖鏡下觀察，F(xiàn)ACHB-905置于血球計數(shù)板上于顯微鏡下觀察，抑制率(Ri)計算公式:Ri=(N0－NS)/N0×100%，其中:N0為對照組藻密度 (cells/mL);NS為實驗組藻密度 (cells/mL)．實驗采用Microsoft Excel 2003進行數(shù)據(jù)整理與分析．

2 結(jié)果

2.1 海藻酸鈉固定化綠茶抑藻劑對ATDH01抑制作用

經(jīng)海藻酸鈉固定化綠茶浸提液處理1 h后，ρ(抑藻劑)≥1.00 g/L的各組對ATDH01的抑制率均超過84%，其他組則接近50%;1～5 h，各組抑制率均緩慢增加;至24 h，ρ(抑藻劑)≥1.00 g/L的各組抑制率均大幅度增加至接近100%;此后，波動維持在較高抑制率水平．但是從24 h開始，0.32 g/L組抑制率一直波動在較低水平上，一般不超過50%;0.56 g/L組抑制率則居中．加入純海藻酸鈉小球的組整個實驗期間抑制率大多在50%左右 (見圖1)．

整個實驗期間，0.32 g/L組海藻酸鈉固定化綠茶粉對ATDH01的抑制率均處于較低水平，最高僅約23%，大部分時間抑制率處于負值;0.56 g/L組在處理5 h內(nèi)抑制率為負值，24 h后抑制率波動升高，最高達93%;處理后前5 h內(nèi)，抑制率隨著抑藻劑質(zhì)量濃度的增加而升高;24 h以后，質(zhì)量濃度在1.00～3.20 g/L的組間抑制率差異不大，抑制率大多在80%以上，最高可達100%(見圖2)．

圖3為綠茶粉對ATDH01的抑制作用，隨著質(zhì)量濃度的增加，綠茶粉對ATDH01的抑制率逐漸增加;隨著時間的延長，各組的抑制率也在增加，且在48 h時各組對ATDH01的抑制率均達到100%．

2.2 海藻酸鈉固定化綠茶抑藻劑對FACHB-905的抑制研究

在相同處理時間里，隨著海藻酸鈉固定化綠茶浸提液質(zhì)量濃度的增加，其對銅綠微囊藻FACHB-905的抑制率也增加，但增加幅度不大．處理1 h后，僅最高質(zhì)量濃度組有約21%的抑制率;最高質(zhì)量濃度組 (3.20 g/L)從處理3 h開始抑制率多大于50%，并且維持較高的抑制率一直到試驗結(jié)束 (144 h);1.00、1.80 g/L組的抑制率波動較大，且抑制率大多低于50%;低質(zhì)量濃度組 (0.32、0.56 g/L)的抑制率一般小于30%．另外，純海藻酸鈉小球抑制率明顯低于0.32 g/L組 (見圖4)．

海藻酸鈉固定化綠茶粉對于FACHB-905的影響與海藻酸鈉固定化綠茶浸提液的相類似，1h內(nèi)抑制率均低于20%，且各組差異不大;此后，一般隨著抑藻劑質(zhì)量濃度的增加抑制率增加;隨著處理時間的延長，抑制率波動較大，除了3.20 g/L組外，抑制率一般不隨時間延長而增加．總體來看，固定化綠茶粉對FACHB-905的抑制率不高，試驗期間平均抑制率最高僅55.09%(出現(xiàn)在3.20 g/L組)，其他組抑制率均低于50%(見圖5)．

2.3 PVA固定化綠茶浸提液的抑藻效果

在1 h內(nèi)，無論空白PVA棉片還是加茶葉浸提液的棉片均不能抑制ATDH01．3 h后各試驗組均有較高抑制率，并且抑制率與抑藻劑的質(zhì)量濃度沒有明顯相關(guān)性，0.63 g/L組抑制率最高 (90.42%)，空白棉片也有78.93%的抑制率．一般來說，抑藻劑的質(zhì)量濃度增加抑制率也增加，但是二者并非呈直線相關(guān)．隨著處理時間延長，抑制率呈波動增加的趨勢．空白棉片在試驗期間一般有大于70%的抑制率 (見圖6)．

圖1 不同質(zhì)量濃度海藻酸鈉固定化綠茶浸提液對ATDH01的抑制率Fig.1 The inhibitory rate of different concentrations of green tea leach liquor immobilized by sodium alginate on ATDH01

圖2 不同質(zhì)量濃度海藻酸鈉固定化綠茶粉對ATDH01的抑制率Fig.2 The inhibitory rate of different concentrations of green tea powder immobilized by sodium alginate on ATDH01

圖3 不同質(zhì)量濃度綠茶粉對ATDH01的抑制作用Fig.3 The inhibitory rate of different concentrations of green tea powder on ATDH01

PVA固定化綠茶浸提液處理FACHB-905 1 h后各組抑制率在16.23%～45.45%之間，即使空白棉片也有16.23%的抑制率;此后，高質(zhì)量濃度組 (0.63～1.60 g/L)抑制率隨著處理時間的延長而增加，低質(zhì)量濃度組則在一定范圍內(nèi)波動．大部分試驗組在試驗期間對銅綠微囊藻FACHB-905的抑制率低于50%，僅有高質(zhì)量濃度組 (0.63～1.60 g/L)在經(jīng)過48 h以上的處理后抑制率才超過50%，最高達83.52%(見圖7)．

圖4 不同質(zhì)量濃度海藻酸鈉固定化綠茶浸提液對FACHB-905的抑制率Fig.4 The inhibitory rate of different concentrations of green tea leach liquor immobilized by sodium alginate on FACHB-905

圖5 不同質(zhì)量濃度海藻酸鈉固定化綠茶粉對FACHB-905的抑制率Fig.5 The inhibitory rate of different concentrations of green tea powder immobilized by sodium alginate on FACHB-905

圖6 不同質(zhì)量濃度PVA固定化綠茶浸提液對ATDH01的抑制率Fig.6 The inhibitory rate of different concentrations of green tea leach liquor immobilized by PVA cotton on ATDH01

圖7 不同質(zhì)量濃度PVA固定化綠茶浸提液對FACHB-905的抑制率Fig.7 The inhibitory rate of different concentrations of green tea leach liquor immobilized by PVA cotton on FACHB-905

3 討論

3.1 不同形式綠茶抑藻劑對ATDHO1的抑制作用比較

試驗結(jié)果顯示，綠茶以粉劑或浸提液的形式被海藻酸鈉固定化后對ATDH01均有極強的抑制作用．ρ(抑藻劑)≥1.0 g/L的組在24 h后都能達到抑制率的第一個高峰 (95% ～100%)，此后，抑制率會有小幅波動，并保持高抑制率直到試驗結(jié)束 (168 h);而0.56 g/L組在24 h以后的抑制率一般都在50%以上，最高可達90%以上;低于0.32 g/L則抑藻作用?。纱丝梢?，以綠茶為抑藻物質(zhì)經(jīng)海藻酸鈉固定化后，使用時其質(zhì)量濃度為0.56 g/L即可達到理想的抑藻效果，1.00 g/L則幾乎可完全抑制．目前，國內(nèi)外研究的甲藻抑藻劑的使用方法多數(shù)都是通過直接潑灑提取液或放入干品抑藻劑的方式，雖迅速，但在大型水域中的效果卻難以持久，本研究則將抑藻劑通過固定緩釋的方式進行利用，亦可取得不錯的抑藻效果．從單純海藻酸鈉小球具有的較高抑藻率 (50%左右)來看，海藻酸鈉固定化綠茶抑藻劑的抑藻機理既有綠茶中抑藻物質(zhì)的作用，也有海藻酸鈉的作用．海藻酸鈉本身并無生物毒性，但由其制作成的固定化小球中含有大量淡水，而ATDH01是海洋微藻，海藻酸鈉小球的加入將釋出其中的淡水使鹽度快速下降，可能是其產(chǎn)生抑藻作用的原因．另外，海藻酸鈉固定化綠茶浸提液比綠茶粉的抑藻效果更快，一般要快5～24 h，這是因為粉劑中抑藻物質(zhì)的釋放需要經(jīng)過溶解的過程，而浸提液則不需要，因此后者起效更快．

從固定材料上看，除了在第一小時外，PVA膠棉固定化綠茶浸提液對ATDH01的抑制效果與海藻酸鈉固定化綠茶浸提液相近，處理第一小時時前者抑制率明顯低于后者;當處理質(zhì)量濃度相同或相近時這兩種固定方法抑制率相近．值得注意的是，除了第一小時外，其他處理時間空白PVA棉片也大多有70%以上的抑制率．相比較而言，加了綠茶浸提液的棉片其抑制率并未有大幅度增加，有些甚至更低．PVA高分子膠棉是一種多孔材料，吸水性和吸附微粒能力極強，它本身所呈現(xiàn)出來的抑藻作用很可能是由其強力的毛細管效應(yīng)使藻細胞被吸附，與其中添加的綠茶浸提液能更密切地接觸，因此具有較好的抑藻功效．實際應(yīng)用中可以考慮以單純的PVA高分子膠棉作為去除ATDH01的材料．

3.2 不同形式綠茶抑藻劑對FACHB-905的抑制作用比較

本試驗中無論是海藻酸鈉固定化綠茶浸提液還是綠茶粉對于FACHB-905的抑制作用均不高，二者差別不大，一般都在50%以下，并且抑制率隨著處理時間的延長增加不大．另外，空白海藻酸鈉小球?qū)τ贔ACHB-905也沒有抑制作用．比較綠茶浸提液以PVA高分子膠棉吸附固定以及以海藻酸鈉固定的兩種方法來看，前者對FACHB-905的抑制率略高、抑制效果略快．處理1 h后海藻酸鈉固定法僅最高質(zhì)量濃度 (3.20 g/L)有21.33%抑制率，而PVA膠棉吸附法則可達45.45%(1.60 g/L)．并且在整個實驗期間吸附法抑藻效果均優(yōu)于海藻酸鈉法．與對ATDH01的抑制情況不同，空白PVA膠棉與海藻酸鈉小球?qū)ACHB-905均無抑制作用，這與兩種微藻的生態(tài)要求不同有關(guān)．FACHB-905是淡水藻，海藻酸鈉小球不會對水體的物理性質(zhì)有太大影響，而FACHB-905細胞也明顯小于ATDH01，從而導(dǎo)致二者受抑制情況差異．從處理效果看，不同固定化形式的綠茶抑藻劑對于FACHB-905來說見效較慢、抑制質(zhì)量濃度較高，應(yīng)用價值有待進一步評估．

3.3 兩種固定化方法對綠茶抑藻劑性能的比較

海藻酸鈉屬于天然高分子凝膠載體，具有對生物無毒、傳質(zhì)性能良好、成形方便且固定化密度高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于各行業(yè)，在水處理方面的應(yīng)用尚在嘗試．本研究首次將其作為抑藻劑的固定化材料，取其環(huán)境友好、有效保持抑藻劑質(zhì)量濃度的特點，有著值得期待的前景．由于其強度較低、抗微生物分解能力較差、在厭氧條件下易被微生物分解[24]的特點，長時間放置在水環(huán)境中可能會影響水質(zhì)．考慮到海藻酸鈉固定化綠茶抑藻劑對ATDH01的抑制一般在數(shù)小時到1 d以內(nèi)即產(chǎn)生明顯效果，采用該方法進行綠茶抑藻劑的固定化是可行的，且可以回收海藻酸鈉小球重復(fù)應(yīng)用．但是對于水華藻FACHB-905的處理則不宜采用，以免其浸泡過久產(chǎn)生降解而致水中有機物含量增加，反而不利于水質(zhì)凈化．

PVA高分子膠棉目前常被制作成日用品，應(yīng)用廣泛，由于其孔徑細小吸水性極佳，作為固定化抑藻劑的材料是十分理想的．同時，其毛細管還可以對水中顆粒物產(chǎn)生吸附作用，從而使藻細胞更接近抑藻劑而受到抑制．這種材料可以按需求制作成任何形狀，方便現(xiàn)場使用．從本研究結(jié)果看，其在抑制赤潮藻ATDH01方面具有理想的效果，但是其對銅綠微囊藻的抑制作用尚有待進一步研究．

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