簡紅朱雷邵晉辰趙藝李傳佳虞永鋒張杰

1.上海交通大學附屬上海市胸科醫(yī)院肺部腫瘤臨床醫(yī)學中心，上海200030；

2.上海交通大學附屬上海市胸科醫(yī)院病理科，上海200030

ERα、ERβ在非吸煙非小細胞肺癌患者中的表達與生存期和性別的相關性研究

簡紅1朱雷2邵晉辰2趙藝1李傳佳1虞永鋒1張杰2

1.上海交通大學附屬上海市胸科醫(yī)院肺部腫瘤臨床醫(yī)學中心，上海200030；

2.上海交通大學附屬上海市胸科醫(yī)院病理科，上海200030

背景與目的：雌激素信號傳導在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中存在爭議，體外實驗發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen receptor，ER)ERβ與肺內(nèi)組織的異常增生相關，ERβ在正常組織和肺癌組織中的表達結(jié)果不同。本研究旨在探討ERα和ERβ在非吸煙NSCLC患者中的表達與臨床病理特征和生存期的關系。方法：收集有組織學病理診斷的144例非吸煙的NSCLC組織及其臨床資料，免疫組化方法檢測ERα和ERβ表達狀況并分析與臨床特點和生存期的關系。結(jié)果：ERα陽性表達率為7.6%，僅在腺癌中表達，ERα表達狀態(tài)與生存期無關。ERβ表達率為52.1%，Ⅰ、Ⅱ期患者的表達顯著高于Ⅲ、Ⅳ期，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.020)。ERβ表達陽性和陰性的中位生存期(median survival time，MST)分別為43和38個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028)，ERβ表達陽性和陰性的女性MST分別為45和37個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)。在腺癌中ERβ陽性和陰性表達的MST分別為46和38個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)。結(jié)論：ERβ在早期非吸煙NSCLC中表達增高，是女性、腺癌生存期良好的標志。

非吸煙；非小細胞肺癌；雌激素受體

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)至今仍是惡性腫瘤致死的主要原因，吸煙已被證實為NSCLC發(fā)病的主要原因，但近20年的流行病學研究顯示，隨著煙草控制的深入，與吸煙相關的男性肺癌發(fā)病率從90年代起在緩慢下降，女性肺癌的發(fā)病率和病死率在持續(xù)上升［1-2］，其中腺癌的比例明顯增高。驅(qū)動基因研究顯示在非吸煙、腺癌中EGFR突變的比例比正常肺癌人群顯著增高，且女性的比例明顯高于男性，并對EGFR的酪氨激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKI)敏感［3］。研究顯示，女性肺癌的臨床特征和生存期與男性肺癌不同［4］，體外研究顯示雌激素受體(estrogen receptor，ER)與腫瘤的增殖有關，但在臨床研究中ER與NSCLC患者的生存期的關系尚無明確的結(jié)論，且是否與研究的人群過于寬泛有關尚不清楚。本研究旨在分析非吸煙NSCLC患者ERα、ERβ的表達與生存期和性別的關系，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集上海胸科醫(yī)院2009年7月—2010年7月手術切除的原發(fā)性初治非吸煙的NSCLC患者，共144例?；颊咝g前均行胸部CT、頭顱CT、骨ECT、腹部B超或全身PET檢查；術式為肺葉或全肺切除術加系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃術；術后分期依照國際肺癌研究協(xié)會(IASLC)2009年的標準，病理分型按WHO/IASLC組織學分類(2004)標準，隨訪生存期至2013年7月。將治療分為單純手術、手術聯(lián)合化療、手術聯(lián)合化療及TKI治療3組。

1.2 ERα、ERβ免疫組化分析

手術標本經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。選取腫瘤組織豐富的石蠟塊連續(xù)切片(4 μm)。其中1張行常規(guī)HE染色，證實為NSCLC；另取2張分別用ERα、ERβ單克隆抗體進行免疫組化染色，1張備用。此外，還包括ERα兔抗人多克隆抗體(1∶50，clone 6F11；Novocastra laboratories)、ERβ (1∶50，clone 14C8；GeneTex Inc)、EnVision試劑(美國DAKO公司)。

組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟3次，每次20 min，梯度乙醇水化后蒸餾水沖洗3次。PBS沖洗，3%過氧化氫甲醇溶液處理。加1滴或50 μL非免疫性動物血清10 min，按照產(chǎn)品指南的方法及要求加入單克隆抗體作為一抗，室溫下溫育24 h。PBS沖洗，加100 μL二抗，室溫下溫育1 h。PBS沖洗，每次5 min，共沖洗3次。滴顯色劑，室溫下溫育10 min。蘇木精套色5 min，沖洗20 min。1%鹽酸酒精分化，沖洗20 min。切片經(jīng)95%，100%乙醇各兩檔脫水，二甲苯透明中性樹膠封片。ER用乳腺癌標本作為陽性對照。

采用免疫組化二步法EnVision System方法檢測ER的表達，采用Olympus光學顯微鏡以200倍觀察切片。ER蛋白陽性細胞為細胞核呈棕黃色，細胞質(zhì)和細胞膜不著色，高倍鏡下隨機選擇5個視野，每個視野記數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分比≥10%者為蛋白表達陽性。

1.3 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計軟件為SPSS 19.0，應用描述性統(tǒng)計，χ2檢驗，Kaplan-Meier分析ERα、ERβ的表達、性別、臨床特點、治療方法等因素與中位生存期(median survival time，MST)的關系，COX多因素分析生存期。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 非吸煙NSCLC患者的基本情況及ERα、ERβ表達狀況

144例非吸煙NSCLC患者中男性49例，女性95例，年齡28～75歲，平均57.6歲，中位年齡59歲。腺癌109例，鱗癌24例，鱗腺癌10例，大細胞癌1例。Ⅰ期64例，Ⅱ期24例，Ⅲ期41例，Ⅳ期15例。單純手術34例，手術聯(lián)合化療40例，手術聯(lián)合化療及TKI治療的共70例，隨訪至2013年7月。ERα、ERβ陽性表達分別為7.6%和52.1%。全組患者的MST為42個月，男性為38(32.80～43.20)個月，女性44(39.3～47.4)個月，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.434)。

2.2 非吸煙NSCLC患者ERα、ERβ表達與臨床病理特征的關系

144例非吸煙NSCLC患者中ERα陽性表達11例，僅為7.6%，表現(xiàn)為細胞核呈棕黃色染色(圖1A)。男性和女性的表達率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.623)。ERα僅在腺癌中表達(10.1%)，鱗癌、鱗腺癌、大細胞癌未見陽性表達。Ⅰ～Ⅳ期患者中ERα的表達率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.800，表1).

144例非吸煙NSCLC患者中75例(52.1%)患者ERβ呈陽性表達，細胞核內(nèi)呈棕黃色染色(圖1B)。男性和女性的表達率差異無統(tǒng)計學意義(P=0.593)。ERβ在腺癌中表達率為51.4%，鱗癌為54.2%，鱗腺癌為50%，大細胞癌為100%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.801)。Ⅰ～Ⅳ期患者中ERβ表達差異有統(tǒng)計學意義(P=0.020，表1)。

圖 1 ERα及ERβ患者在非吸煙NSCLC中的表達Fig. 1 Expression of ERα in non-smoking NSCLC patients (DAB, ×200)

表 1 非吸煙NSCLC患者ERα、ERβ表達與不同性別、病理分型及分期的關系Tab. 1 The relationship between the expressions of ERα and ERβ in non-smoking NSCLC and different gender, pathological types and stage

2.3 ERα、ERβ表達與非吸煙肺癌生存期和性別的關系

隨訪至2013年7月，隨訪期為48個月，144例非吸煙NSCLC患者的MST為42個月，男性為38個月，女性44個月，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.434)。病理類型差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，分期顯示Ⅰ期和Ⅱ期的生存期明顯優(yōu)于Ⅲ期和Ⅳ期，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。單純手術組生存期優(yōu)于手術聯(lián)合化療及TKI組，而手術聯(lián)合化療及TKI組生存期優(yōu)于手術聯(lián)合化療組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2)。ERα陰性表達的MST為41個月(95%CI：36.34～45.66)，ERα陽性表達的MST為45個月(95%CI：30.33～59.66)，盡管ERα陽性表達的生存期優(yōu)于ERα陰性表達，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.671)。進一步分析ERα表達陽性的患者生存期與性別、病理類型和分期的關系，因陽性表達率低，SPSS無法給出MST。

144例非吸煙NSCLC患者中ERβ陽性表達為52.1%，其陽性表達的MST為43(38.74～44.06)個月，明顯高于陰性表達的38(35.33～40.67)個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028)。男性患者ERβ表達陽性和陰性的MST分別均為45和38個月，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而女性患者ERβ表達陽性和陰性的MST分別均為45和37個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)。在腺癌患者中，ERβ表達為陽性和陰性的MST分別為46和38個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)；鱗癌、腺鱗癌患者的MST與ERβ的表達狀態(tài)之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。ERβ表達狀態(tài)在不同的治療組中差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表2)。多因素分析生存期僅與分期相關，Ⅰ期、Ⅱ期是生存期延長的主要因素(表3，圖2)。

圖 2 144列患者不同因素影響下的生存期分析Fig. 2 The survival curves of 144 patients by different factors

表 2 非吸煙NSCLC患者ERβ表達與生存期的關系Tab. 2 Expressions of ERβ in non-smoking NSCLC and the correlation with median survival time (MST)

表 3 多因素分析總生存期相關數(shù)據(jù)Tab. 3 Multivariate analysis of overall survival

3 討 論

Chaudhuri等［5］研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中存在ER，現(xiàn)已知ER有ERα、ERβ兩種亞型；通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，雌二醇對肺癌細胞株和正常肺纖維細胞有增殖效應，用雌二醇進行溫育，肺癌傳代細胞株增殖增加17倍，而正常肺纖維細胞增殖增加僅3.8倍，提示惡性細胞對雌激素的反應更敏感。有研究發(fā)現(xiàn)，早期絕經(jīng)的婦女患肺腺癌的風險下降，而雌激素替代治療的患者肺癌發(fā)病風險明顯升高，女性絕經(jīng)前較絕經(jīng)后更易患廣泛性的病變和腺癌，絕經(jīng)前肺癌患者相關病死率與年輕男性相似，而絕經(jīng)后女性患者的病死率低于老年男性［6-8］。雌激素的致癌作用與雌激素代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物有關，這些產(chǎn)物可使DNA損傷、斷裂，導致基因突變。雌激素在生理濃度下并不產(chǎn)生致癌結(jié)果，但在較高的濃度下，在具有兒茶酚雌激素合成酶系和(或)滅活兒茶酚雌激素的酶系活性低下的器官則可能發(fā)生腫瘤。其促進雌激素依賴性腫瘤的增殖可通過以下機制：①調(diào)節(jié)與細胞分裂有關的早期基因，如c-myc、c-jun和c-fos的表達，促進DNA合成和細胞分裂；②調(diào)節(jié)與細胞周期有關的調(diào)節(jié)蛋白，如cyclin B2的表達而影響細胞的增殖；③刺激生長因子如表皮生長因子、胰島素樣生長因子Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子-α的表達而促使細胞增殖［9-12］。

本研究結(jié)果提示，在非吸煙NSCLC中，ERα和ERβ的表達狀況是不同的，ERα陽性表達率為7.6%，僅在腺癌中表達，在鱗癌、鱗腺癌、大細胞癌中無表達。盡管ERα陽性表達的患者生存期優(yōu)于陰性患者，然而其由于表達率低，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而ERβ表達率為52.1%，Ⅰ、Ⅱ期患者表達明顯高于Ⅲ、Ⅳ期。ERβ陽性表達為預后良好，ERβ陽性和陰性表達患者的MST分別為43和38個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.028)。ERβ表達與性別相關，其表達陽性和陰性的女性患者MST分別為45和37個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033)，ERβ表達陽性和陰性的腺癌患者MST分別為46和38個月，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)。由此可見，非吸煙NSCLC患者ERβ陽性表達主要發(fā)生在肺癌早期，是女性腺癌預后良好的標志。ERβ表達狀況在不同的治療組中生存期差異無統(tǒng)計學意義，預示其并不是一個預測療效的指標。多因素分析結(jié)果顯示，影響生存期的因素僅為分期。

Siegfried等［13］的研究結(jié)果顯示，ERβ在肺癌組織中的表達率為40%～69%，Mohit等［14］報道為87.5%，Li等［15］報道為89.0%，均顯著高于本研究的結(jié)果，究其原因為本組患者為非吸煙NSCLC，女性占66%，Ⅰ、Ⅱ期患者占61.7%，為相對預后良好的人群。Navaranam等［16］報道了一項75%為早期患者的研究，其ERβ陽性率為51%，而在相對晚期的BR18的人群中為49%，對于ER的表達是否與性別、病理類型呈正相關，目前尚無統(tǒng)一的觀點。Wu等［17］采用免疫組化方法研究301例Ⅰ～Ⅲ期NSCLC患者手術切除標本的ERβ表達，結(jié)果顯示，女性患者的陽性率為53%，高于男性的39.7%(P=0.012)，并發(fā)現(xiàn)ERβ表達與患者的生存期明顯相關，是預后良好的標志。然而這一結(jié)果并沒有被廣泛驗證，大量的研究仍局限在ER的表達水平。Navaratnam等［16］的研究結(jié)果顯示，在早期和晚期NSCLC患者中，ERβ的表達情況對應著不同的生存期，早期肺癌中無論單因素還是多因素分析結(jié)果均顯示，ERβ是預后良好的標志，而在晚期患者中，ERβ是預后不良的標志，可能是因為腫瘤在不同期別信號傳導因子的活性和通路不同，如TGFβ家族在乳腺癌進展中會出現(xiàn)不同亞基的表達，導致ERβ在功能上擔任不同信號傳導機制的活性分子。ER調(diào)節(jié)多種信號因子，在肺腺癌中調(diào)節(jié)MK蛋白的表達從而調(diào)控EMT促進轉(zhuǎn)移，而ERβ與芳香化酶有高度一致的協(xié)同表達，與肺癌性別依賴的生存優(yōu)勢密切相關。鑒于ER的復雜性，有必要按不同人群、期別進行研究。

［1］ JEMAL A, SIEGEL R, XU J, et al. Cancer statistics, 2010［J］. Cancer J Clin, 2010, 60: 277-300.

［2］ JEMAL A, THUN M J, RIES L A, et al: Annual report to the nation on the status of cancer, tobacco use, and tobacco control［J］. J Natl Cancer Inst, 2008, 100: 1672-94.

［3］ MOK T S, WU Y L, THONGPRASERT S, et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma［J］. N Engl J Med, 2009, 361: 947-957.

［4］ JIAN H, ZHAO Y, LIAO M L, et al. The analysis of clinic characteristic and survival by gender in resected NSCLC［J］. China Oncol, 2012, 22(11): 825-830.

［5］ CHAUDHURI P K, THOMAS P A, WALKER M J, et al. Steroid receptors in human lung cancer cytosols［J］. Cancer Lett, 1982, 16(3): 327-332.

［6］ ADAMI HO, PERSSON I, HOOVER R, et al. Risk of cancer in women receiving hormone replacement therapy［J］. Int J Cancer, 1989, 44: 833-839.

［7］ SCHWAARTZ A G, WENZLAFF A S, PRYSAK G M, et al. Reproductive factors, hormone use, estrogen receptor expression and risk of non-small cell lung cancer in women［J］. J Clin Oncol, 2007, 25(36): 5785-5792.

［8］ GRIDELLI C, LANGER C, MAIONE P, et al. Lung cancer in the elderly［J］. J Clin Oncol, 2007, 25: 1898-1907.

［9］ TANG H, LIAO Y, CHEN G, et al. Estrogen upregulates the IGF-1 signaling pathway in lung cancer through estrogen receptor-β［J］. Med Oncol, 2012, 29(4): 2640-2648.

［10］ ZHAO G, NIE Y, LV M, et al. ERβ-mediated estradiol enhances epithelial mesenchymal transition of lung adenocarcinoma through increasing transcription of midkine［J］. Mol Endocrinol, 2012, 26(8): 1304-1315.

［11］ GARON E B, PIETRAS R J, FINN R S, et al. Antiestrogen fulvestrant enhances the antiproliferative effects of epidermal growth factor receptor inhibitors in human non-small-cell lung cancer［J］. J Thorac Oncol, 2013, 8(3): 270-278.

［12］ TANG H, LIAO Y, XU L, et al. Estrogen and insulin-like growth factor 1 synergistically promote the development of lung adenocarcinoma in mice［J］. Int J Cancer, 2013, 133(10): 2473-2482.

［13］ SIEGFRIED J M, HERSHBERGER P A, STABILE L P. Estrogen receptor signaling in lung cancer［J］. Semin Oncol, 2009, 36(6): 524-531.

［14］ MOHIT K V, YASUHIRO M, KEIKO A, et al. Co-expression of estrogen receptor beta and aromatase in Japanese lung cancer patients: gender-dependent clinical outcome［J］. Life Sci, 2012, 91(15-16): 800-808.

［15］ LI L, WANG H, DU J, et al. Expressions and clinicopathological characteristics of ertrogen receptor α,βand epidermal growth factor in non-small cell lung cancer［J］. Modern Oncol, 2013, 21(3): 539-543.

［16］ NAVARATNAM S, SKLIRIS G, QING G, et al. Differential role of estrogen receptor beta in early versus metastatic nonsmall cell lung cancer［J］. Horm Cancer, 2012, 3: 93-100.［17］ WU C, CHANG Y, SHIH J, et al. The significance of estrogen receptor beta in 301 surgically treated non-small cell lung cancers［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 2005, 130(4): 979-986.

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《循證醫(yī)學編輯部》

Relationships between survival and expressions of estrogen receptor α and β in non-smoking nonsmall cell lung cancer patients

JIAN Hong1, ZHU Lei2, SHAO Jin-chen2, ZHAO Yi1, LI Chuan-jia1, YU Yong-feng1, ZHANG Jie2(1.Shanghai Lung Tumor Clinical Medical Center, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China; 2.Department of Pathology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China)

ZHANG Jie E-mail: jiezhang49@hotmail.com

Background and purpose: The involvement of estrogen signaling in lung cancer is controversial. But the findings showed that ERβ might play an important role in neoplastic lung biology. Several studies have evaluated expression of ERβ in both normal and neoplastic human lung tissues with variable conclusions. We aimed to evaluate the expressive of estrogen receptors (ER) α, β in non-smoking non-small cell lung cancer (NSCLC) and investigate the relationships between the survival and expressions of ERα, β. Methods: Immunohistochemical assay was used to detect the expression ERα and ERβ in 144 NSCLC patients, and analyzed the expressions status of ERα, β and survival. Results: The positive rate of ERα was 7.6%, only in adenocarcinoma cancer. The positive rate of ERβwas 52.1%, and the expressions of stage Ⅰ and Ⅱ was significantly higher than that of stage Ⅲ and Ⅳ (P=0.020). The median survival time (MST) of ERβ positive expression was better than that of negative expression (43 months vs 38 months, P=0.028). The MST of ERβ positive expression of female patients was better than that of negative expression (45 months vs 37 months, P=0.033). The MST of ERβ positive expression of adenocarcinoma were 46 months and better than negative 38 months (P=0.021). Conclusion: The expression of ERβ was significantly higher in early-stage non-smoking NSCLC. It indicated that the positive expression of ERβ was related to the better MST, especially in female adenocarcinoma patients.

Non-smoking; NSCLC; Estrogen receptor

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.11.010

R734.2

：A

：1007-3639(2013)11-0910-07

2013-08-10

2013-10-15）

上海市衛(wèi)生局課題(No：2008127)。

張杰 E-mail:jiezhang49@hotmail.com