陸媛媛張潔清梁少鳳李力

1. 廣西貴港市人民醫(yī)院婦科，廣西 貴港537100；

2. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，廣西 南寧 530021

雌激素通過激活A(yù)KT通路產(chǎn)生的細(xì)胞因子增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力

陸媛媛1張潔清2梁少鳳2李力2

1. 廣西貴港市人民醫(yī)院婦科，廣西 貴港537100；

2. 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，廣西 南寧 530021

背景與目的：目前認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生可能與無拮抗的雌激素長期作用有關(guān)，但雌激素如何調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用機(jī)制尚不清楚。AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞生存和增殖的一個(gè)重要調(diào)節(jié)信號(hào)。本研究探討在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞HEC-1A中，雌二醇能否通過激活A(yù)KT通路產(chǎn)生細(xì)胞因子，以及其對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。方法：蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)技術(shù)檢測雌二醇作用HEC-1A細(xì)胞后AKT活化情況，以及AKT抑制劑、ER抑制劑對(duì)AKT活化的影響。熒光定量PCR及ELISA技術(shù)檢測雌二醇(E2組)作用于HEC-1A細(xì)胞30 min后；或雌激素受體抑制劑(ER組)、AKT抑制劑(AKT組)分別預(yù)處理細(xì)胞1 h后再加入雌二醇作用30 min后，細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF)、bFGF、IL-8基因mRNA表達(dá)及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中蛋白表達(dá)。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化，CFSE法檢測細(xì)胞增殖能力。結(jié)果：E2組的AKT活化比值較對(duì)照組顯著升高(P=0.006 2)，ER組和AKT組的AKT活性比值較E2組顯著降低(P=0.006 0和P=0.006 4)，但不能完全抑制雌二醇作用。E2組的VEGF、bFGF、IL-8 mRNA或蛋白的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P均＜0.01)；在ER組及AKT組中VEGF、bFGF、IL-8 mRNA或蛋白的表達(dá)均明顯低于E2組(P均＜0.05)；雌二醇作用HEC-1A細(xì)胞后，細(xì)胞增殖數(shù)明顯增多，細(xì)胞周期加快(P均＜0.01)。結(jié)論：在HEC-1A細(xì)胞，雌二醇可能通過激活A(yù)KT信號(hào)通路產(chǎn)生VEGF、bFGF、IL-8因子，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力。

雌二醇；子宮內(nèi)膜癌；AKT；增殖

子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。目前認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生可能與無拮抗的雌激素長期作用有關(guān)。磷脂酰肌醇-3- 激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)介導(dǎo)的信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與細(xì)胞的凋亡、增殖、分化和代謝等密切相關(guān)。本研究以雌二醇及其相關(guān)抑制物作用于人子宮內(nèi)膜癌HEC-1A細(xì)胞，探討雌二醇能否通過激活A(yù)KT信號(hào)通路產(chǎn)生細(xì)胞因子，以及其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的影響，為預(yù)防子宮內(nèi)膜癌提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 細(xì)胞株

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A[雌激素受體(estrogen receptor，ER)弱陽性]由北京大學(xué)魏麗惠教授惠贈(zèng)。細(xì)胞在DMEM高糖完全培養(yǎng)液含10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)及傳代。

1.1.2 主要試劑

總RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司；熒光定量PCR試劑購自德國Roche公司；水溶性雌二醇購于美國Sigma公司；ER抑制劑ICI182，780購于英國Tocris公司；AKT抑制劑購于美國Alexis公司；兔抗血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF)抗體購于美國Santa Cruz公司；兔抗人bFGF抗體購于美國Cell-signaling公司；AKT/ p-AKT一抗抗體購自美國Cell signaling公司；兔抗人GAPDH一抗購于南寧中加聯(lián)合抗體公司；遠(yuǎn)紅外二抗DyLight 680購于美國KPL公司。人IL-8、人bFGF以及人VEGF ELISA試劑均購自上海依科賽生物公司；CFSE熒光染料購自美國Molecular Probes公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測AKT蛋白表達(dá)

以1×10-6mol/L雌二醇作用HEC-1A細(xì)胞30 min；或以25×10-6mol/L AKT抑制劑、1×10-6mol/L ER抑制劑預(yù)處理HEC-1A細(xì)胞1 h后，再以1×10-6mol/L雌二醇作用30 min，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入1∶1 000稀釋的AKT，或1∶2 000稀釋的p-AKT抗體4 ℃過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗檢測雜交蛋白。用Odyssey紅外熒光成像掃描儀進(jìn)行掃描成像。目的條帶用Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行蛋白定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.2 熒光定量PCR(qPCR)檢測細(xì)胞VEGF、bFGF、IL-8 mRNA的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，在無血清培養(yǎng)液溫育24 h細(xì)胞生長至70%～80%融合。實(shí)驗(yàn)設(shè)4組：①雌二醇組(E2組)：加入濃度為1×10-6mol/L 雌二醇作用30 min；②ER抑制劑組(ER組)：1×10-6mol/L ER抑制劑預(yù)處理1 h后，加入1×10-6mol/L 雌二醇作用30 min；③AKT抑制劑組(AKT組)：25×10-6mol/L AKT抑制劑預(yù)處理1 h后，加入1×10-6mol/L雌二醇作用30 min；④對(duì)照組：僅加入無血清DMEM培養(yǎng)液。各組細(xì)胞用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qPCR檢測。根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則設(shè)計(jì)引物序列如下：VEGF的上、下游引物分別為5’-GAATCATCACGAAGTGG TGAAGT-3’和5’-GCACACAGGATGGCT TGAAG-3’；bFGF的上、下游引物分別為5’-TATTTCTTTGGCTGCTA CTTG-3’和5’-TCCAGCATTTC GGTGTTG-3’；IL-8的上、下游引物分別為5’-TACTCCAAACCTTTCCACCC-3’和5’-CAAAAACTTCTCCACAACCC-3’。引物由Invitrogen公司合成。以GAPDH看家基因作為內(nèi)參照，GAPDH的上、下游引物分別為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Master(ROX)10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加水至20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃15 s；55～60 ℃(收集熒光)15 s，40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用美國ABI公司的StepOne熒光定量PCR儀和StepOne_Software_v2.1軟件進(jìn)行qPCR和結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)所獲得的數(shù)據(jù)采用比較Ct值法(2-ΔΔCT法)進(jìn)行相對(duì)定量分析。RQ值為經(jīng)過2-ΔΔCT運(yùn)算后得到。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 ELISA檢測細(xì)胞蛋白的表達(dá)

細(xì)胞分組同上文。4 ℃收集細(xì)胞，10 000×g離心10 min，上清液置-80 ℃保存。雙抗體夾心ELISA法檢測上清液中VEGF、bFGF、IL-8蛋白表達(dá)，按照試劑盒說明書操作。測定各樣本450 nm處A值，以試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)品A值與零孔A值之差為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.2.4 細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長的HEC-1A細(xì)胞，每孔500個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后加入1×10-6mol/L的雌激素，或無血清的DMEM液作為對(duì)照，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用30 min后，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，鏡下計(jì)數(shù)各孔所形成的細(xì)胞集落數(shù)，以50～100個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆。終止培養(yǎng)后用PBS洗滌2次，95%乙醇固定20 min后，再用PBS洗滌2次，用HE染色，顯微鏡下(×10倍)計(jì)算集落數(shù)?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化

取對(duì)數(shù)生長期的HEC-1A細(xì)胞1×106接種于6孔板中，加入1×10-6mol/L的雌激素，或無血清的DMEM液作為對(duì)照，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用30 min后，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA含量分布，操作按周期試劑盒說明書。

1.2.6 CFSE法檢測細(xì)胞生長曲線

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用 CFSE標(biāo)記后接種于6孔板，使每孔細(xì)胞數(shù)為1×105，加入1×10-6mol/L的雌激素或無血清的DMEM液作為對(duì)照，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，作用30 min后，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)分別于24、48、72及96 h后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料結(jié)果以x±s 表示。方差分析法進(jìn)行各組間差異的比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同藥物作用于細(xì)胞后AKT活化情況

AKT活化以p-AKT/AKT/GAPDH比值表示。E2組的AKT活化比值較對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 2)；ER組及AKT組的AKT活化比值較E2組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006 0和0.006 4，圖1)。

圖 1 雌二醇作用HEC-1A細(xì)胞30 min后p-AKT和總AKT蛋白印跡電泳圖Fig. 1 Effects of estradiol on p-AKT and total AKT protein in HEC-1A cells after 30 min

2.2 各組細(xì)胞VEGF、bFGF、IL-8 mRNA和蛋白的表達(dá)

qPCR檢測結(jié)果顯示，E2組VEGF、bFGF、IL-8 mRNA的表達(dá)分別為對(duì)照組的44.20、26.52和34.85倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、P=0.001、P=0.004)；ER組、AKT組VEGF、bFGF、IL-8 mRNA的表達(dá)與E2組相比均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012，P=0.003和P=0.027)和(P=0.006，P=0.012和P=0.005，圖2)。

圖 2 HEC-1A細(xì)胞VEGF，bFGF和IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig. 2 The mRNA expression of VEGF, bFGF and IL-8 in HEC-1A cells

ELISA檢測結(jié)果顯示，E2組中VEGF、bFGF、IL-8蛋白與對(duì)照組相比表達(dá)增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 1，P=0.000和P=0.000)；ER組、AKT組VEGF、bFGF、IL-8的蛋白表達(dá)與E2組相比均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.002和P=0.001)和(P=0.000，P=0.000和P=0.000，表1)。

2.3 雌激素對(duì)細(xì)胞集落形成的影響

HEC-1A細(xì)胞經(jīng)E2培養(yǎng)30 min后，E2組集落形成率為(43.4±3.08)%，對(duì)照組為(36.4±1.44)%，兩者相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.566，P=0.023，圖3)。

圖3 HEC-1A細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)Fig.3 The clone formation assay of HEC-1A cells

2.4 雌激素對(duì)細(xì)胞周期的影響

E2作用于HEC-1A細(xì)胞后，E2組G1期細(xì)胞在所占比例為(55.63±0.56)%，對(duì)照組為(71.15±5.62)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.756，P=0.009)，E2組G2期及S期細(xì)胞所占比例分別為(9.36±0.72)%和(8.62±1.18)%，對(duì)照組為(35.00±0.17)%和(20.21±6.73)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.941，t=-3.782，P=0.042，P=0.019)。

2.5 雌激素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

HEC-1A細(xì)胞在E2培養(yǎng)30 min，并經(jīng)24、48、72和96 h溫育后，E2組細(xì)胞增殖數(shù)分別為(6.95±0.82)個(gè)、(8.00±0.82)個(gè)、(9.36±0.48)個(gè)和(9.75±0.50)個(gè)，對(duì)照組分別為(5.20±0.91)個(gè)、(6.5±0.58)個(gè)、(7.75±0.96)個(gè)和(8.75±0.50)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為-3.365、-2.611、-3.030和-2.820，P值分別為0.015、0.04、0.023、0.03，圖4)。

表 1 不同組別中VEGF、bFGF、IL-8蛋白的表達(dá)量Tab. 1 Expression level of VEGF, bFGF, IL-8 protein in different groups(pg/mL)

圖 4 CFSE法檢測HEC-1A細(xì)胞增殖圖Fig. 4 CFSE labeling method for cell proliferation

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤，與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生密切相關(guān)的雌激素可以非轉(zhuǎn)錄機(jī)制快速激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT激酶級(jí)聯(lián)而調(diào)節(jié)內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與凋亡［1］。AKT作為多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵中樞效應(yīng)蛋白，是細(xì)胞生存和增殖的一個(gè)重要調(diào)節(jié)信號(hào)。Guo等［2］的研究發(fā)現(xiàn)在雌激素作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞能夠使AKT磷酸化，磷酸化效果最顯著的時(shí)間HEC-1A為15 min，并都至少能持續(xù)2 h。因此，本研究以1×10-6mol/L雌二醇作用HEC-1A細(xì)胞后，p-AKT蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比較明顯升高；ER抑制劑、AKT抑制劑作用后，p-AKT蛋白表達(dá)明顯下降，提示ER抑制劑能阻礙雌二醇與ER結(jié)合，從而抑制活化AKT。但也發(fā)現(xiàn)AKT抑制劑作用后，p-AKT蛋白表達(dá)降低幅度比ER抑制劑大，說明抑制AKT比競爭性抑制雌激素與ER結(jié)合的效果顯著，同時(shí)也說明雌二醇激活A(yù)KT是非ER依賴的，提示p-AKT參與了腫瘤的發(fā)生，這與以往的研究結(jié)果一致［3］。

雌激素通過非轉(zhuǎn)錄機(jī)制快速激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT信號(hào)通路可從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤血管形成［4］。為了解子宮內(nèi)膜癌中E2與細(xì)胞因子間的關(guān)系，本研究以雌二醇溫育EC-1A細(xì)胞后，E2組VEGF、bFGF、IL-8 mRNA或蛋白的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(P均＜0.05)；加入ER抑制劑或AKT抑制劑后，VEGF、bFGF、IL-8 mRNA或蛋白的表達(dá)明顯降低；且AKT抑制劑比ER抑制劑更能阻抑細(xì)胞產(chǎn)生VEGF、bFGF或IL-8蛋白，提示雌二醇可能經(jīng)ER非依賴性的方式通過激活A(yù)KT通路產(chǎn)生VEGF、bFGF、IL-8因子。在ER陰性HEC-1A細(xì)胞，雌激素主要與細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中的ER結(jié)合后，迅速激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過通路中的效應(yīng)分子，參與細(xì)胞的增殖效應(yīng)。

實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移需要持續(xù)的新生血管，VEGF是促血管活性因子，與受體結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖、遷移，促進(jìn)腫瘤新生血管形成［5–6］；bFGF是細(xì)胞生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子，具有促血管形成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移等活性；Presta等［7］研究發(fā)現(xiàn)，bFGF和VEGF有協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移作用。IL-8是重要的趨化因子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。本課題的前期研究表明雌二醇誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞產(chǎn)生VEGF、bFGF和IL-8，是通過激活A(yù)KT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的［8］。本研究結(jié)果顯示，E2作用于HEC-1A細(xì)胞30 min后，細(xì)胞中的VEGF、bFGF、IL-8基因與蛋白的表達(dá)量增加。為了研究這些因子與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞惡性生物行為的關(guān)系，本研究又給予1×10-6mol/L的E2誘導(dǎo)HEC-1A細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)。細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞比例顯著下降，G2期、S期細(xì)胞比例顯著升高；細(xì)胞遷移、侵襲能力顯著增強(qiáng)。這些結(jié)果顯示，雌激素作用后產(chǎn)生的VEGF、bFGF、IL-8明顯促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生、遷移和侵襲。

綜上所述，E2通過非轉(zhuǎn)錄效應(yīng)激活A(yù)KT通路產(chǎn)生VEGF、bFGF、IL-8因子，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。

［1］ MATHEWS J, WIHLEN B, TUJAGUE M, et al. Estrogen receptor (ER) beta modulates ERalpha-mediated transcriptional activation by altering the recruitment of c-Fos and c-Jun to estrogen-responsive promoters ［J］. Mol Endocrinol, 2006, 20(3): 534-543.

［2］ GUO R X, WEI L H, TU Z, et al. 17β-Estradiol activates PI3K/Akt signaling pathway by estrogen receptor (ER)-dependent and ER-independent mechanisms in endometrial cancer cells ［J］. J Steroid Biochem Mol Biol, 2006, 99(1): 9-18.

［3］ 湯建民, 何權(quán)瀛, 常秀軍. 磷酸化Akt和PTEN在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性［J］. 中國癌癥雜志, 2005, 15(6): 541-545.

［4］ SKINNER H D, ZHENG J Z, FANG J, et al. Vascular endothelial growth factor transcriptional activation is mediated by hypoxia-inducible factor 1 alpha, HDM2 and p70S6K1 in response to phosphatidylinositol 3 kinase/AKT signaling［J］. J Biol Chem, 2004, 279 (44): 45643- 45651.

［5］ JANG Y J, KIM D S, JEON O H, et al. Saxatilin suppresses tumor-induced angiogenesis by regulating VEGF expression in NCI-H460 human lung cancer cells ［J］. J Biochem Mol Biol, 2007, 40(3): 439-443.

［6］ MOLDOVAN N I. Angiogenesis, I’enfant terrible of vascular biology is coming of age ［J］. J Cell Mol Med, 2005, 9(4): 775-776.

［7］ PRESTA M. Sex hormones modulate the synthesis of basic fibroblast growth factor in human endometrial adenocarcinoma cells: implications for the neovascularization of normal and neoplastic endometrium［J］. J Cell Physiol, 1998, 137(3): 593-597.

［8］ 丁蘭芳, 王曉謙, 陸媛媛, 等. 雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞AKT通路中細(xì)胞因子的影響［J］. 中國腫瘤臨床, 2011, 38(20): 1262-1266.

《抗癌》雜志征稿啟事

《抗癌》雜志于1988年創(chuàng)刊，主管單位為上海市科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)，主辦單位為上海市抗癌協(xié)會(huì)，雜志刊號(hào)：CN31-1664/R ISSN 1008-3065。征稿欄目及內(nèi)容如下。

一、《抗癌博客》欄目

記錄癌癥患者自強(qiáng)不息、熱愛生活、勇敢面對(duì)病痛和生活壓力的故事，能夠啟發(fā)其他患者自信和勇敢的精神，幫助他們建立積極、知足、感恩和達(dá)觀的生活態(tài)度?？梢允悄愕挠H身經(jīng)歷，也可以是醫(yī)生治療患者時(shí)的所見所聞，或是你身邊發(fā)生的故事。

二、《正誼明道、大醫(yī)精誠》欄目

真實(shí)記錄醫(yī)生對(duì)患者的關(guān)懷；或是愛崗敬業(yè)、精益求精富有專業(yè)精神的事跡，能讓更多醫(yī)道同仁敬重和學(xué)習(xí)?？梢灾v述患者眼里的醫(yī)生，也可以記錄你的同事。

以上稿件《抗癌》雜志編輯部在發(fā)表時(shí)有修改的權(quán)力，如果不同意修改請(qǐng)注明，謝謝！歡迎各位作者踴躍投稿。

來稿請(qǐng)寄：上海市東安路270號(hào)6號(hào)樓3樓《抗癌》雜志社

郵 編：200032 電 話：021-64043766

傳 真：021-64043766 E-mail：anti-cancer@163.com

Estradiol enhances the proliferation of endometrial cancer cells by producing angiogenesis by activating AKT pathway

LU Yuan-yuan1, ZHANG Jie-qing2, LIANG Shao-feng2, LI Li2(1.Department of Gynecology, Guigang City People’s Hospital, Guigang Guangxi 537100, China; 2.Department of Gynecologic Oncology, Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University, Nanning Guangxi 530021, China)

ZHANG Jie-qing E-mail: zjq201008@hotmail.com

Background and purpose: The occurrence of endometrial cancer may be related to the persistent stimulus of endogenous and exogenous estrogen without progesterone antagonist. But how does estrogen regulate cell proliferation is still unknown. AKT pathway is the most important signal transduction way to mediate proliferation in the cells. The main aim was to study whether estradiol induces the expression of VEGF, bFGF and IL-8 in the endometrial cancer HEC-1A cells by activating AKT, and its effect on proliferation. Methods: Western blot was used to detect the expression of AKT protein in HEC-1A cells after estradiol stimulation, AKT inhibitor or ER inhibitor stimulation followed by estradiol. Real-time PCR and ELISA were used to detect the gene and protein expression of VEGF, bFGF and IL-8 in different inhibitors. Cell colony formation assay, flow cytometry and CFSE assay were used to examine the proliferation in HEC-1A cells. Results: The expression of p-AKT protein in HEC-1A cells after stimulation with estradiol was markedly higher than that in the control group (P=0.006 2); the expression of p-AKT protein in AKT inhibitor group and ER inhibitor group were significantly decreased than that in estradiol group (P=0.006 0, P=0.006 4). qPCR and ELISA showed the mRNA and protein expression of VEGF, bFGF, IL-8 in estradiol group were significantlyincreased than that in control group (P＜0.05); The expressions of VEGF, bFGF, IL-8 in AKT inhibitor group and ER inhibitor group were significantly decreased than that in estradiol group (P＜0.01). The abilities of proliferation and cell cycle were significantly increased in HEC-1A cells after estradiol stimulation. Conclusion: Estrogen induces the production of VEGF, bFGF and IL-8 through activating AKT signal pathway.

Estrogen; Endometrial cancer; AKT; Proliferation

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.11.003

R737.33

：A

：1007-3639(2013)11-0868-06

2013-04-18

2013-08-20）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No：81160318)；廣西自然科學(xué)基金(No：桂科回0991016)。

張潔清 E-mail:zjq201008@hotmail.com