楊 智 符碧薇 江朝娜 藍(lán)永洪

(海南醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101)

甲胎蛋白(AFP)常常作為臨床診斷原發(fā)性肝癌的一個(gè)臨床指標(biāo)〔1〕。肝纖維化與肝癌的發(fā)生有著密切的關(guān)系，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的增加與肝纖維化有著密切關(guān)系〔2〕，因此α-SMA也用來(lái)輔助診斷原發(fā)性肝癌。本研究通過(guò)建立大鼠肝癌模型，研究大鼠肝癌進(jìn)展過(guò)程中α-SMA和AFP的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠，體重160～200 g，約10周齡，購(gòu)自于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)中心，寄養(yǎng)于潔凈動(dòng)物房?jī)?nèi)，給予自由飲水和標(biāo)準(zhǔn)飲食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 二乙基亞硝胺(美國(guó)Sigma公司)，鼠抗人平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(上海億欣生物試劑公司)，DAB試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，山羊血清(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)，染色液(湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝癌模型的建立 選取SD大鼠65只，隨機(jī)分為對(duì)照組21只，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均飲用滅菌食用水。實(shí)驗(yàn)組35只，前4 w飲用滅菌食用水配置的二乙基亞硝胺，濃度100μg/ml，連續(xù)飲用4 w后，改飲普通滅菌食用水。與此同時(shí)另取9只SD大鼠，處理方法同實(shí)驗(yàn)組，作為實(shí)驗(yàn)備用組，用于作為實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物中途死亡的補(bǔ)充。

1.2.2 大鼠肝癌模型的病變過(guò)程 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的生存狀況，并分別在第6，8，10，12，14，16，18 周處死5只實(shí)驗(yàn)組和3只對(duì)照組大鼠，取肝組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀測(cè)大鼠肝癌模型的進(jìn)展?fàn)顩r。對(duì)所取組織常規(guī)行10%甲醛固定、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.2.3 大鼠肝臟組織中α-SMA的表達(dá) 將上述取得的各組大鼠的組織立即固定，石蠟包埋制成切片，采用免疫組化技術(shù)測(cè)定大鼠肝臟組織中α-SMA的表達(dá)。結(jié)果分為:(－)陰性;(+)弱陽(yáng)性;(?)陽(yáng)性和(?)強(qiáng)陽(yáng)性。

1.2.4 血清中AFP的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在第6，8，10，12，14，16，18周處死大鼠時(shí)，分別取大鼠的血，離心取血清，按照試劑盒的操作規(guī)范，使用ELISA法分別檢測(cè)AFP的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，所有數(shù)據(jù)均以表示，采用t檢驗(yàn)，制圖采用Graphpad Prism 5.0軟件。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的生存狀況 對(duì)照組大鼠無(wú)異?，F(xiàn)象，食欲良好，活動(dòng)自如，無(wú)自然死亡。實(shí)驗(yàn)組大鼠在實(shí)驗(yàn)前期(前6 w)，與對(duì)照組無(wú)明顯變化，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加(8～18 w)，實(shí)驗(yàn)組部分大鼠出現(xiàn)食欲不振，活動(dòng)減少狀況，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)大鼠死亡2例，死亡率5.71%，死亡大鼠又實(shí)驗(yàn)備用組大鼠補(bǔ)充繼續(xù)試驗(yàn)。

2.2 大鼠肝癌模型的病變過(guò)程 在第 6，8，10，12，14，16，18周處死5只實(shí)驗(yàn)組和2只對(duì)照組大鼠，分別取出大鼠的肝臟，稱(chēng)取大鼠肝臟的重量。對(duì)照組大鼠從第6～18周，肝臟的重量只有少量增加;而實(shí)驗(yàn)組從第6～18周增加明顯。并且從第10周開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟的重量與對(duì)照組大鼠肝臟的重量相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟的重量明顯重于對(duì)照組大鼠。見(jiàn)表1。

肝組織的電鏡圖顯示，對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列規(guī)則。實(shí)驗(yàn)組大鼠6、8 w大鼠肝組織出現(xiàn)纖維化;第10周開(kāi)始出現(xiàn)肝硬化，有假小葉產(chǎn)生，為肝癌初發(fā)期;第12、14周出現(xiàn)肝細(xì)胞異性，產(chǎn)生肝癌結(jié)節(jié)為早期肝癌現(xiàn)象;第16、18周出現(xiàn)肝癌細(xì)胞向正常組織浸潤(rùn)生長(zhǎng)，為肝癌晚期癥狀。見(jiàn)圖1。

2.3 大鼠肝臟組織中α-SMA的變化 對(duì)照組大鼠α-SMA在第6～18周在肝臟組織中基本不表達(dá)，或表達(dá)極弱。而實(shí)驗(yàn)組大鼠第6周表達(dá)極弱呈陰性(－);第8～10周肝癌初發(fā)時(shí)期，表達(dá)量有所增加，呈弱陽(yáng)性(+);第12～14周早期肝癌，α-SMA表達(dá)呈陽(yáng)性(?);第16～18周晚期肝癌期，α-SMA表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性(?)。

2.4 血清AFP的變化 對(duì)照組大鼠在第6～18周，血清AFP濃度基本上無(wú)變化;實(shí)驗(yàn)組大鼠在第6～18周內(nèi)，血清AFP濃度逐漸增大，且實(shí)驗(yàn)組大鼠在第 10、12、14、16、18周與相應(yīng)時(shí)間的對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

表1 各組大鼠在肝癌進(jìn)展過(guò)程中的肝臟重量，g)

表1 各組大鼠在肝癌進(jìn)展過(guò)程中的肝臟重量，g)

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3 討論

由于原發(fā)性肝癌是我國(guó)致死率較高的惡性腫瘤之一，因此建立完善的診斷標(biāo)準(zhǔn)十分緊迫。我國(guó)目前使用的是由中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，血清AFP含量以及結(jié)合影像學(xué)資料作為重要的指標(biāo)〔4〕，但隨著科技進(jìn)步以及經(jīng)驗(yàn)的積累發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚有不足之處。但血清AFP含量作為原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)目前已發(fā)現(xiàn)有假陽(yáng)性和假陰性〔5〕，因此尚需結(jié)合各種新的肝癌標(biāo)記物綜合診斷。因此為了臨床更準(zhǔn)確的診斷原發(fā)性肝癌，我們進(jìn)行研究以期發(fā)現(xiàn)新的原發(fā)性肝癌標(biāo)記物。

本研究采用的建立大鼠肝癌模型的方法，成功率高，為臨床研究原發(fā)性肝癌提供新的思路。綜上所述，根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)α-SMA及AFP含量的隨著肝癌的進(jìn)展逐漸增加，因此α-SMA結(jié)合AFP作為診斷指標(biāo)更能準(zhǔn)確地診斷原發(fā)性肝癌。

1 王麗娜，鞠吉雨，鄭 潔，等.AFP-L3、HSP70及AFP水平在大鼠肝癌發(fā)展中的動(dòng)態(tài)變化〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010;7(22):13-5.

2 季巍巍，宋育林，路 燕.非酒精性肝纖維化 a-SMA、E-鈣黏素和Twist1的變化及意義〔J〕.安徽醫(yī)藥，2012;16(5):588-91.

3 劉 揚(yáng)，吳孟超，錢(qián)光相，等.血液AFP mRNA在復(fù)發(fā)性肝癌及伴有肝外遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的原發(fā)性肝癌中的診斷意義〔J〕.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999;20(3):192-3.

4 孟憲鏞.肝癌標(biāo)記物研究進(jìn)展〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，1999;17(2):54-8.