劉江月 張代娟 劉同美 郭軍堂 李香玲

(濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山東 濰坊 261042)

糖尿病(DM)引起的大血管病變?nèi)绻跔顒?dòng)脈性心臟病、腦血管病及周?chē)懿∫殉蔀镈M患者致死、致殘的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是2型糖尿病(T2DM)常見(jiàn)的伴發(fā)病之一。越來(lái)越多的證據(jù)揭示，鐵代謝和糖代謝之間存在相互影響，二者的關(guān)系可能是雙向的，即鐵代謝異?？梢杂绊懱谴x;而長(zhǎng)期高血糖又可損傷鐵代謝通路〔1〕。鐵儲(chǔ)存的增加預(yù)示著T2DM的發(fā)生，鐵誘導(dǎo)的損傷還會(huì)影響到DM并發(fā)癥的發(fā)展。本研究旨在探討T2DM血管并發(fā)癥與鐵代謝之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性 Wistar大鼠，清潔級(jí)，日齡30～50 d，體重160～180 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK魯20090017。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ)(美國(guó)Sigma公司);胰島素放免試劑盒(北京原子高科技股份有限公司);血糖(BS)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品);糖化血紅蛋白(HbA1c)測(cè)試盒(美國(guó)Bio公司);轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)多克隆抗體(美國(guó)Sigma公司);sTfR酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(美國(guó)BPB生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn))。

1.3 動(dòng)物分組及模型建立 Wistar大鼠分為對(duì)照組、模型組各10只。①對(duì)照組:喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料不作任何處理(蛋白質(zhì)占23%，碳水化合物占53%，脂肪占5%);②模型組:動(dòng)物以自制高糖高脂飼料喂養(yǎng)1個(gè)月(含碳水化合物占48%，脂肪占22%，蛋白質(zhì)占20%)誘導(dǎo)胰島素抵抗后，按25 mg/kg腹腔注射STZ誘發(fā)DM，2 w后測(cè)量尾靜脈血糖濃度達(dá)到16.7 mmoL/L為建模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 檢測(cè)項(xiàng)目及方法 各組分別于最后1 d禁食12 h。然后腹腔注射3%戊巴比妥鈉1 ml/kg，麻醉固定后，快速由頸總動(dòng)脈取血4～5 ml，室溫靜置20 min后，離心10 min，分離血清，檢測(cè)BS、采用微柱親和層析法測(cè)定HbA1c、放射免疫法檢測(cè)胰島素(INS)及sTfR水平。同時(shí)取主動(dòng)脈壁，分別固定、－80℃超低溫冰箱保存，以備電鏡觀察和TfR mRNA表達(dá)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般情況 對(duì)照組大鼠毛色光澤，活動(dòng)自如，活潑，飲食正常。模型組大鼠體重增長(zhǎng)較快，皮下脂肪厚，但隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，毛色色澤暗淡，活動(dòng)減少，精神狀態(tài)較差，進(jìn)食量減少。

2.2 各組BS、HbA1c、INS、ISI值的比較 模型組BS、HbA1c、INS均明顯高于對(duì)照組，而ISI明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 各組總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平比較 模型組 TC、TG、LDL水平均明顯高于對(duì)照組，而HDL明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 血清sTfR水平的比較 模型組大鼠血清sTfR較對(duì)照組顯著升高〔(4.25±0.18)vs(2.92±3.75)mg/L，P＜0.05〕。

2.5 主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞TfR mRNA表達(dá) 模型組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞TfR mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯升高(0.826±0.003 vs 0.213±0.001，P ＜0.05)。

2.6 T2DM大鼠主動(dòng)脈弓動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞核內(nèi)異染色質(zhì)成團(tuán)塊狀分布于核周，胞質(zhì)內(nèi)有正常形態(tài)和大小的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體和線(xiàn)粒體，所觀察的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上都有豐富的核糖體。模型組可見(jiàn)主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞成異常改變，核內(nèi)電子密度升高，異染色質(zhì)增多，胞質(zhì)內(nèi)大量線(xiàn)粒體出現(xiàn)明顯嵴斷裂、空泡樣變、髓鞘樣變，高爾基復(fù)合體內(nèi)出現(xiàn)大空泡。見(jiàn)圖1。

2.7 血清 sTfR 水平與 BS、HbA1c、INS、ISI、TC、TG、LDL、HDL的關(guān)系 模型組 sTfR水平與 BS、HbA1c、INS呈明顯正相關(guān)(r=0.23、0.26、0.21，P ＜0.05)，與HDL呈負(fù)相關(guān)(P ＜0.05)。

表1 各組大鼠BS、HbA1c、INS、ISI的比較=10)

表1 各組大鼠BS、HbA1c、INS、ISI的比較=10)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05，下表同

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表2 各組大鼠TC、TG、LDL、HDL的比較，n=10)

表2 各組大鼠TC、TG、LDL、HDL的比較，n=10)

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3 討論

近年來(lái)Brownlee〔2〕提出，高血糖致內(nèi)皮細(xì)胞線(xiàn)粒體活性氧簇(ROS)生成增加是DM血管病變發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素。而鐵是體內(nèi)最重要的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)促進(jìn)劑，可啟動(dòng)或催化Haber-Weiss反應(yīng)，產(chǎn)生ROS，并能使低活性自由基轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚宰杂苫貏e是通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基。高活性自由基及其他氧化產(chǎn)物是損傷血管舒張及引起內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)生性抗氧化劑缺失的主要因子。同時(shí)鐵和ROS可作為生長(zhǎng)因子促進(jìn)血管平滑肌增生，在動(dòng)脈硬化粥樣斑塊形成過(guò)程中，鐵蛋白基因表達(dá)是提高的〔3〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，AS的動(dòng)脈內(nèi)膜細(xì)胞質(zhì)含鐵量明顯高于AS組織，且鐵沉積量與AS程度直接相關(guān)〔4〕。本研究提示T2DM大鼠大血管病變可能與TfR mRNA高表達(dá)有關(guān)，而TfR mRNA高表達(dá)與高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加及氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)。

胰島素是一種合成激素，它刺激細(xì)胞攝取許多營(yíng)養(yǎng)素。腸道吸收非血紅素鐵是與人體的需求緊密相關(guān)的，人體內(nèi)總鐵儲(chǔ)存正常時(shí)這種鐵的攝取量很小。然而，血紅素鐵的吸收卻不依賴(lài)于總鐵含量。穩(wěn)態(tài)下，循環(huán)鐵是通過(guò)高親和力的特異的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體從血液中吸收的，并與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合在一起。TfR復(fù)合物被吞入細(xì)胞后，釋放進(jìn)入一個(gè)無(wú)酸性的細(xì)胞間隔中，消化成為細(xì)胞基本的組成成分。胰島素可以顯著加速脂肪細(xì)胞攝取鐵，將TfR重新由細(xì)胞內(nèi)膜間隔分布到細(xì)胞表面，從而介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)鐵的攝取，致使細(xì)胞內(nèi)鐵超負(fù)荷。在鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)，INS也影響鐵蛋白合成的增加〔5〕。更重要的是，TfR使得胰島素敏感的葡萄糖載體和胰島素樣生長(zhǎng)因子受體在微粒體膜上聚集，意味著胰島素調(diào)節(jié)鐵的攝取與其調(diào)節(jié)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)存在著關(guān)聯(lián)。相反地，鐵也影響胰島素的功能。鐵干擾胰島素限制肝糖輸出的作用。鐵負(fù)荷增加可以抑制肝臟攝取和清除胰島素，干擾胰島素對(duì)肝糖原異生的抑制作用，造成循環(huán)中高胰島素血癥〔6〕。這樣，胰島素與鐵潛在的相互作用形成惡性循環(huán)，加重胰島素抵抗和誘導(dǎo)DM的發(fā)生。本研究提示高胰島素血癥可能導(dǎo)致鐵代謝紊亂，T2DM大鼠大血管病變可能與高胰島素血癥導(dǎo)致鐵代謝紊亂有關(guān)。

1 Fernandezr JM，Lope BA，Ricart W.Cross-talk between iron metabolism and diabetes〔J〕.Diabete，2002;51(8):2348-54.

2 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications〔J〕.Nature，2001;414(3):813.

3 Wu EX，Kim D，Tosti CL，et al.Magnetic resonance assessment of iron overload by separate measurement of tissue ferritin and hemosiderin iron〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2010;1202(2010):115-22.

4 Vlasakova Z，Pelikanova T，Kazadova L，et al.Serum ferritin，oxidation and risk factors for atherogenes in healthy of spring of hypertensive patients〔J〕.Vnitr Lek，2002;48(2):105-11.

5 Cameron NE，Cotter MA.Effects of an extracellular metal chelator on neurovascular function in diabetic rats〔J〕.Diabetologia，2001;44(5):621-8.

6 賈 悅，董凌燕.鐵元素在糖尿病中的作用〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·內(nèi)科學(xué)分冊(cè)，2004;31(5):201.