肖忠盛， 王 松， 梁慶模， 龍建武， 李 衛(wèi)

2012年衛(wèi)生部發(fā)布的“2003至2007年中國結(jié)直腸癌發(fā)病與死亡分析”顯示我國結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率高于世界平均水平和發(fā)展中國家水平，還指出中國結(jié)腸癌發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。積極探尋安全、經(jīng)濟(jì)、有效的治療結(jié)腸癌的化療藥尤為重要［1］。生長抑素類似物奧曲肽可通過下調(diào)Wnt/βcatenin通路，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及使細(xì)胞停滯在G1期，而奧曲肽如何通過激活通路信號，改變重要靶基因尚需進(jìn)一步探討［2-3］。本研究通過分析奧曲肽對Wnt/β-catenin通路核心分子β-catenin、下游“聯(lián)姻分子”TCF-4及靶基因 C-myc、CyclinD1的影響，探討奧曲肽抑制Wnt/β-catenin通路的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購自上海中科院細(xì)胞庫。醋酸奧曲肽購自諾華制藥公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。DMSO、MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品。胰蛋白酶系美國Amresco公司研發(fā)。牛血清系杭州四季青公司研發(fā)。BCA蛋白定量試劑盒、Western Blot BeyoECL Plus發(fā)光試劑、考馬斯亮藍(lán)、預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。β-actin單抗為美國Santa Cruz生物公司產(chǎn)品。羊抗人β-catenin多抗、兔抗人CyclinD1單抗、兔抗人C-myc單抗為ABZOOM公司產(chǎn)品。兔抗人TCF-4單抗為美國EPITOMICS公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG為美國Jackson Immuno Reasearch公司產(chǎn)品。PVDF膜為美國Millipore公司產(chǎn)品。過硫酸胺(APS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺(acrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、蛋白酶抑制劑(PMSF)、甘氨酸溴酚藍(lán)均為上海生物工程公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測奧曲肽對SW480細(xì)胞的增殖抑制作用 處理組以奧曲肽干預(yù)，設(shè)置濃度分別為10－12M、10－11M、10－10M、10－9M、10－8M、10－7M及10－6M共7個亞組;對照組為空白細(xì)胞加生理鹽水干預(yù)。結(jié)腸癌SW480細(xì)胞處于對數(shù)生長期，經(jīng)0.25%胰酶消化處理制成細(xì)胞懸浮液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液180 μL，每孔細(xì)胞數(shù)為6×103個，置飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%)。培養(yǎng)6 h細(xì)胞貼壁后，加入20 μL生理鹽水或者不同濃度奧曲肽，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h在培養(yǎng)板中每孔加入20 μL的MTT液(5 g·L－1)。吸去上層培養(yǎng)基，每孔加入100 μL二甲基亞砜，震蕩10 min待紫藍(lán)色沉淀充分溶解后，酶標(biāo)儀在570 nm波長測吸光度值(A值)。計算抑制率，抑制率=(1－處理組A值/對照組A值)×100%。以上每組設(shè)4個平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.2.2 Western blot測定 β-catenin、TCF-4、C-myc、CyclinD1蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，以2×108/L的密度接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶1 mL，再加完全培養(yǎng)基4 mL，在溫度為37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，每瓶加入5 mL不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，同步化24 h后，每瓶分別加入奧曲肽使終濃度為10－6M、10－8M、10－10M，培養(yǎng)48 h。提取細(xì)胞核內(nèi)的蛋白，BCA測蛋白濃度并定量。Western blot法:制備 SDSPAGE凝膠，用蒸餾水沖洗上樣孔;測定蛋白含量，計算并調(diào)整樣品濃度，加入2×SDS凝膠上樣緩沖液，將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性，加足夠電泳液后開始上樣，用微量移液器貼壁吸取樣品，將加樣器針頭插入加樣孔內(nèi)，加入樣品，每孔上樣40 μg蛋白;取28 mA恒流進(jìn)行電泳，電泳約30 min后待樣品溴酚藍(lán)行至分離膠、積層膠界面，再以120 V恒壓、約1.5 h行分離膠電泳;將凝膠中蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(預(yù)先用甲醇處理)，溫度為4℃，恒流105 mA，3h;5%脫脂奶粉封閉室溫下2 h;4℃孵育一抗(β-catenin羊多克隆抗體、TCF-4兔單克隆抗體、CyclinD1兔單克隆抗體、C-myc兔單克隆抗體，以抗體稀釋液稀釋，濃度依抗體而定)每次孵育一種抗體過夜，TBST液洗膜3次，每次約5 min;室溫下二抗(1∶5 000)孵育1 h，TBST液洗膜3次，每次約5 min;于暗室中加入Western Blot發(fā)光試劑約1 min，X片曝光、顯影、定影，膠片掃描后采用AlphaImagerTM2200軟件測定印跡區(qū)帶的灰度面積值。每一種蛋白的Western blot實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3遍。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值)±標(biāo)準(zhǔn)差 (s)表示，處理組與對照組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 奧曲肽對SW480細(xì)胞的增殖的抑制作用

奧曲肽對SW480細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果見表1、圖 1。結(jié)果提示濃度為 10－10M、10－9M、10－8M、10－7M及10－6M的奧曲肽可抑制SW480細(xì)胞的增殖，且在一定濃度范圍(10－10M～10－8M)內(nèi)對SW480細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度依賴性，但奧曲肽濃度在10－8M及以上時，并不提高抑制效果。奧曲肽作用于SW480細(xì)胞在48 h內(nèi)細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間依賴性，且在48 h時間點(diǎn)對細(xì)胞增殖抑制作用最強(qiáng)，超過48 h后抑制作用不再隨著時間延長而增強(qiáng)。

表1 奧曲肽對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長抑制作用

圖1 奧曲肽對SW480細(xì)胞生長的抑制作用變化趨勢圖

2.2 奧曲肽對SW480細(xì)胞核中β-catenin蛋白的影響

通過 Western-blot法檢測，濃度為 10－6M、10－8M、10－10M的奧曲肽作用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞48 h后，與對照組比較，細(xì)胞核中β-catenin蛋白表達(dá)減少，印跡區(qū)帶的灰度面積掃描值處理組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義，且各濃度組間亦有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)，見圖2、3。

2.3 奧曲肽對SW480細(xì)胞核中TCF-4蛋白的影響

圖2 奧曲肽對SW480細(xì)胞核內(nèi)β-catenin

圖3 奧曲肽對SW480細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)的影響

通過Western-blot法檢測濃度為10－6M 、10－8M、10－10M的奧曲肽作用SW480細(xì)胞48 h后，細(xì)胞核中TCF-4蛋白表達(dá)減少，印跡區(qū)帶的灰度面積掃描值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，處理組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義，各濃度組間亦有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)，見圖4、5。

圖4 奧曲肽對SW480細(xì)胞核內(nèi)TCF-4

圖5 奧曲肽對SW480細(xì)胞核內(nèi)TCF-4蛋白表達(dá)的影響

2.4 奧曲肽對SW480細(xì)胞核中C-myc蛋白的影響

通過 Western-blot法檢測濃度為 10－6M、10－8M、10－10M的奧曲肽作用SW480細(xì)胞48 h后，細(xì)胞核中C-myc蛋白表達(dá)減少，印跡區(qū)帶的灰度面積掃描值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，處理組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義，且各濃度組間亦有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)，見圖 6、7。

圖6 奧曲肽對SW480細(xì)胞核內(nèi)C-myc

圖7 奧曲肽對SW480細(xì)胞核內(nèi)C-myc蛋白表達(dá)的影響

2.5 奧曲肽對SW480細(xì)胞核中CyclinD1蛋白的影響

通過 Western-blot法檢測濃度為 10－6M、10－8M、10－10M的奧曲肽作用SW480細(xì)胞48 h后，細(xì)胞核中CyclinD1蛋白表達(dá)減少，印跡區(qū)帶的灰度面積掃描值經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，處理組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義，且各濃度組間亦有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.01)，見圖8、9。

圖8 奧曲肽對SW480細(xì)胞核內(nèi)CyclinD1

圖9 奧曲肽對SW480細(xì)胞核內(nèi)CyclinD1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

奧曲肽是一種人工合成的8肽生長抑素類似物，半衰期長，皮下注射半衰期可達(dá)2 h，且對內(nèi)分泌的抑制作用較強(qiáng)，停藥后不發(fā)生“反跳性高分泌”，因此其臨床應(yīng)用廣泛。動物試驗(yàn)認(rèn)為奧曲肽能降低化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的結(jié)腸癌的發(fā)生率，并能抑制其發(fā)展［4］。臨床研究發(fā)現(xiàn)晚期結(jié)腸癌患者通過應(yīng)用奧曲肽治療可明顯緩解患者癥狀、提高其生活質(zhì)量［5］。我們的前期工作也提示在體外條件下，奧曲肽可通過下調(diào) Wnt/β-catenin通路而抑制結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞［2-3］。

在本研究中，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)奧曲肽在10－10M以上能抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖，且在一定濃度范圍(10－10M ～10－8M)呈現(xiàn)濃度依賴性，在10－8M時對SW480細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(約35%)，與Dy等［6］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。奧曲肽濃度超過10－8M對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用不再隨著濃度的增加而增強(qiáng)，考慮為奧曲肽通過與生長抑素受體結(jié)合而發(fā)揮抗腫瘤作用，而受體具有飽和特性。本研究發(fā)現(xiàn)奧曲肽作用在48 h內(nèi)對SW480細(xì)胞的增殖抑制作用呈時間依賴性，但作用超過48 h后對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用不再隨著時間的延長而增強(qiáng)，考慮可能與奧曲肽在體外降解有關(guān)。

β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的樞紐分子。在正常結(jié)腸細(xì)胞中，胞質(zhì)β-catenin主要參與細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，與E-cadherin及α-catenin結(jié)合形成復(fù)合體，作用與維持細(xì)胞間的黏附防止細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)，少部分游離的β-catenin在胞漿內(nèi)被降解復(fù)合體磷酸化后由泛素蛋白酶體識別并降解，保持胞內(nèi)β-catenin低水平狀態(tài)，通路處于失活狀態(tài)。而當(dāng)WNT處于激活狀態(tài)時(如結(jié)腸癌SW480細(xì)胞)，由APC 蛋白、GSK-3β、Axin、β-catenin等形成的“降解復(fù)合體”受到抑制，使β-catenin不被GSK-3β磷酸化從而避免了泛素蛋白酶體對其識別和降解，進(jìn)而在胞質(zhì)中逐漸積聚;當(dāng)β-catenin在胞漿中積聚到一定濃度時即向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，并與胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子TCF4結(jié)合，導(dǎo)致下游靶基因的啟動因子暴露而被激活(如C-myc、Cyclin-D1等)，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和凋亡抵抗［7］。本研究中檢測了奧曲肽作用后的SW480細(xì)胞核內(nèi)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)核內(nèi)β-catenin、TCF-4蛋白表達(dá)水平是明顯下降的，并且下游的靶基因CyclinD1和C-myc蛋白的表達(dá)也得到明顯下降。結(jié)合前期工作，我們考慮奧曲肽在SW480細(xì)胞中抑制Wnt/β-catenin通路的機(jī)制為:在該通路上游(細(xì)胞質(zhì)內(nèi))通過上調(diào)APC2、CK1α分子，重新聚合“降解復(fù)合體”，下調(diào) β-catenin、TCF4，或減少β-catenin往細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，從而減少 β-catenin-TCF4復(fù)合體形成，下游靶基因啟動子激活受抑，最終使得C-myc、Cyclin-D1下降。

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