李 容,蔣林斌,覃 濤,梁榕珊
(1.右江民族醫(yī)學院藥學系,廣西百色533000;2.廣西大學化學化工學院,廣西南寧530004)
色素分為天然色素和人工合成色素。天然色素相對合成色素具有以下優(yōu)點:安全性高、無毒副作用、色調(diào)和氣味自然,有人體必需的營養(yǎng)成分,具有生理和保健功能[1]。因此,天然色素越來越受到人們的重視,開發(fā)和利用天然色素已成為趨勢。
豆科(Leguminosae)羊蹄甲屬(Bauhinia)植物在全世界約有600種,我國約有40種,主要分布在南方[2]。紅花羊蹄甲(Bauhinia blakeana Dunn.)又名洋紫荊、艷紫荊,為羊蹄甲屬中比較常見的品種,常用作觀賞花木。紅花羊蹄甲花期長、花量大、花色艷、花味香,但長期以來僅供觀賞后任其自生自滅,未加利用,非??上А<t花羊蹄甲花中含有豐富的天然紅色素,該色素水溶性好,色值高,具有較大的研究和開發(fā)價值[3]。目前,從紅花羊蹄甲花中提取色素的研究非常少,其色素穩(wěn)定性方面的研究并未見報道。本文研究了紅花羊蹄甲花色素的提取工藝和穩(wěn)定性,旨在為該花卉資源的可持續(xù)利用提供參考。
紅花羊蹄甲花瓣 采自百色市右江區(qū)街道兩旁,將花瓣陰干,粉碎后置干燥避光處備用;鹽酸、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氫氧化鈉、氯化鉀、氯化鈉、氯化鎂、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣、綠化鋁、氯化鐵、亞硫酸鈉、過氧化氫、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、苯甲酸鈉 均為國產(chǎn)分析純。
TU-1800型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;pHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠;FD-1A-50型真空冷凍干燥機 上海比朗儀器有限公司;3-18K型離心機 SIGMA公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海安亭實驗儀器有限公司;KQ500DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FA1104型電子分析天平 上海天平儀器廠;FZ102型植物粉碎機 上海銳豐儀器儀表有限公司;HHS-21-4型電熱式恒溫水浴鍋 江蘇金壇宏凱儀器廠;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。
1.2.1 工藝流程 鮮羊蹄甲花→自然風干→粉碎→加入溶劑超聲波提取→抽濾→離心(取少量測吸光度)→減壓濃縮→低溫真空干燥→色素固體。
1.2.2 提取溶劑的選擇 稱取7份2g羊蹄甲花,各加入95%乙醇溶液、75%乙醇溶液、0.2mol/L鹽酸溶液、酸性乙醇溶液(乙醇體積分數(shù)為75%,pH=1)、丙酮、乙酸乙酯、蒸餾水各100mL作提取劑。室溫浸提5h,抽濾得色素原液,觀察色素溶液顏色,以溶劑為空白,測色素液在可見光區(qū)的最大吸收波長及吸光度值。
1.2.3 最大吸收波長的確定 取5份羊蹄甲花1g,各加入不同濃度的鹽酸100mL作提取劑,室溫浸提2h,抽濾得色素原液,以溶劑為空白,在400~700nm范圍內(nèi)掃描吸收光譜。
1.2.4 單因素實驗 考察鹽酸濃度、固液比、超聲功率、超聲時間對提取效果的影響。色素的提取效果用最大吸收波長處的吸光度值來表示[4]。稱取5份1g羊蹄甲花,各加入不同濃度的鹽酸50mL,在超聲波功率90W下提取20min,抽濾,取濾液5mL(1∶10濾液)定容至50mL,測吸光度;稱取5份1g羊蹄甲花,各加入濃度為0.3mol/L的鹽酸35、50、65、80、95mL,在超聲功率90W的條件下提取20min,抽濾,定容,測吸光度;稱取5份1g羊蹄甲花,各加入濃度為0.3mol/L的鹽酸65mL,改變超聲功率,提取20min,抽濾,定容,測吸光度;稱取5份1g羊蹄甲花,加入濃度為0.3mol/L的鹽酸65mL,在超聲功率為90W的條件下提取不同時間,抽濾,定容,測吸光度。
1.2.5 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,設置因素水平范圍,進行L9(34)正交實驗,確定最佳提取工藝條件,因素水平設置見表1。
表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
1.2.6 色素的穩(wěn)定性研究 配制一定濃度的色素溶液,在不同的條件下測定其吸光度值的變化,考察pH、溫度、光照、金屬離子、氧化劑和還原劑、食品添加劑等對色素穩(wěn)定性的影響[5]。
羊蹄甲花粉末經(jīng)不同溶劑浸提后結(jié)果見表2,由表2可知紅花羊蹄甲紅色素在極性較大的溶劑中溶解性較好,在極性較小的乙酸乙酯中幾乎不溶,說明羊蹄甲花紅色素為水溶性色素。從色素液顏色及吸光度值分析,鹽酸液和酸性乙醇液都是較好的提取溶劑,綜合考慮溶劑殘留及生產(chǎn)成本等問題,故選擇鹽酸作為紅花羊蹄甲紅色素的提取劑。
羊蹄甲花色素的最大吸收波長受pH影響較大,考察pH對最大吸收波長的影響,實驗結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,pH<4.5時色素的最大吸收波長在(520±1)nm內(nèi),且吸光強度較大;當pH為6時最大吸收波長明顯紅移,吸光強度減小,這表明色素結(jié)構隨pH減小而改變。由于本實驗在測吸光度時均在<6的條件下進行,故選定520nm作為測定波長。
圖1 羊蹄甲花紅色素吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of pigment from Bauhinia blakeana Dunn flower
圖2 鹽酸濃度對提取效果的影響Fig.2 Effect of hydrochloric acid concentration on extraction
表2 提取溶劑的選擇Table 2 Effect of different solvents on pigment extraction
2.3.1 鹽酸濃度對色素提取效果的影響 從圖2可知,吸光度隨鹽酸濃度先增大而后緩慢減小,濃度0.3mol/L時達最大,其可能的原因是,大部分花中的色素都是花色苷類,pH對花色苷類物質(zhì)結(jié)構影響很大,花色苷在酸性條件下較穩(wěn)定,但也可能導致花色苷降解[6],因此選擇提取溶劑的最佳濃度為0.3mol/L。
2.3.2 固液比對色素提取效果的影響 從圖3可知,在固液比大于1∶65時,隨著固液比的減小,色素的吸光度值增大,但小于1∶65后吸光度增加緩慢。這表明紅色素在料液比1∶65的條件下已基本溶出。固液比太大,羊蹄甲花粉末與提取溶劑不能充分接觸,使色素不能全部溶出;固液比太小浪費溶劑,給后期濃縮也帶來一定困難[7],因此,選擇1∶65作為最佳條件。
圖3 固液比對色素提取效果的影響Fig.3 Effect of solid to liquid ratio on extraction
2.3.3 超聲波功率對色素提取效果的影響 從圖4可知,吸光度先隨超聲功率的增加而增大,超過120W后又降低。超聲功率增大,加大了破壁程度,有利于色素溶出,但超聲功率達到一定值后吸光度值開始下降,這可能是因為超聲波具有較強的機械切力作用,作用強度過大可能改變色素的結(jié)構[8]。綜合考慮選擇90W作為最佳提取功率。
圖4 超聲功率對色素提取效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction
2.3.4 超聲波時間對色素提取效果的影響 由圖5可知,吸光度隨提取時間的增加而增大,到30min達最大值,而后又呈下降趨勢。超聲作用時間長熱效應使局部溫度過高,可能會使色素不穩(wěn)定,大部分色素中含有酚羥基,易被氧化而脫色[9]。因此,較合適的超聲時間為30min。
圖5 超聲時間對色素提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction
以鹽酸為提取溶劑,采用超聲波輔助提取羊蹄甲花紅色素,影響紅色素提取的主要因素是超聲波功率、固液比、提取溶劑濃度、浸提時間,幾種因素相互影響,因此進行L9(34)正交實驗。根據(jù)單因素實驗結(jié)果,設置因素水平范圍,確定最佳提取工藝條件,正交實驗結(jié)果見表3。
表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Result of orthogonal experiment
從表3分析可知,各因素對紅色素提取的影響因素順序為B>C>D>A,即超聲功率>鹽酸濃度>提取時間>液料比;最優(yōu)水平是A3B2C2D3,即超聲波提取紅花羊蹄甲花色素的最佳工藝為:液料比1∶80,超聲功率120W,鹽酸濃度0.3mol/L,提取時間40min。在最優(yōu)水平的條件下進行了3次驗證性實驗,測得色素液的吸光度值分別為1.415、1.403、1.420,平均值為1.407,高于正交表中的實驗號2的實驗結(jié)果;RSD為0.80%,說明最佳工藝條件具有良好的重現(xiàn)性。
2.5.1 pH對色素穩(wěn)定性的影響 用HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)色素溶液的pH,觀察色素顏色變化,實驗結(jié)果見表4。從表4可看出,羊蹄甲花紅色素在酸性條件下色素顏色變化不大,較穩(wěn)定。在堿性條件下色素溶液顏色已經(jīng)發(fā)生改變,因此在提取和應用中宜采用酸性條件。pH對天然色素的影響主要是使天然色素的結(jié)構或組成發(fā)生變化,從而使其顏色發(fā)生變化[10]。
表4 pH對色素顏色的影響Table 4 Effect of different pH conditions on the stability of the pigment
表5 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of metal ions on the stability of the pigment
表6 氧化還原劑對色素穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of oxidant/reductant on the stability of the pigment
2.5.2 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 取多份色素溶液,分別置于20、40、60、80、100℃的溫度下加熱4h,在最大吸收波長下測定吸光度值所示,實驗結(jié)果見圖6。從圖6可知,羊蹄甲花色素在溫度為20℃和40℃條件下,吸光度隨加時間的延長基本沒有變化,在60、80、100℃吸光度隨時間的延長呈下降趨勢,但在60℃條件下下降幅度不大,由此可見當溫度超過80℃后溫度對色素影響較大。這可能是該色素在加熱過程中發(fā)生氧化反應,導致的共價鍵斷裂以及在此基礎上的進一步反應引起的[11]。因此在制備和存儲羊蹄甲花色素時應盡量在低溫條件下進行。
圖6 不同溫度對色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of different temperatures on the stability of the pigment
2.5.3 光照對色素穩(wěn)定性的影響 將相同濃度的色素溶液分別置于室外自然光、室內(nèi)自然光、避光的環(huán)境下放置7h,測定吸光度值,實驗結(jié)果見圖7。從圖7可知,羊蹄甲花色素在室內(nèi)自然光、避光的條件下,吸光度值幾乎沒有變化,在室外自然光下隨時間的延長吸光度有所下降,但7h下降的幅度不超過5%,說明羊蹄甲花色素有較好的光穩(wěn)定性。
圖7 光照對色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of different lights conditions on the stability of the pigment
2.5.4 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響 配制含有K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Fe3+濃度為100mg/L的色素溶液及空白色素溶液,避光放置,分別在1、24h測定溶液吸光度,觀察溶液的顏色,實驗結(jié)果見表5。從表5可知,加入K+、Na+、Ca2+離子使色素吸光度值略有增大,對羊蹄甲花色素有一定的增色、護色作用[12]。加入Zn2+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Fe3+使色素吸光度值減小,甚至觀察到加入Fe3+離子的色素液變?yōu)樽厣?,表明這些離子對色素的穩(wěn)定性影響較大,其原因可能是離子會與色素反應,使色素退色或生成其他顏色的物質(zhì)[13]。因此在制備和存儲羊蹄甲花色素時應盡量避免與Zn2+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Fe3+接觸。
2.5.5 氧化劑、還原劑對色素穩(wěn)定性的影響 配制含亞硫酸鈉、雙氧水不同濃度的色素溶液及空白色素溶液,測定溶液吸光度,觀察溶液的顏色,實驗結(jié)果見表6。從表6可知,加入氧化劑和還原劑后,色素的吸光度值在較短的時間內(nèi)下降很大,顏色也消退,氧化劑和還原劑濃度越大影響越明顯。因此,氧化劑和還原劑對色素的穩(wěn)定性影響很大,在使用過程應避免加入氧化劑和還原劑。
2.5.6 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響 配制含5%葡萄糖、5%蔗糖、1%檸檬酸、1%苯甲酸鈉的色素溶液及空白色素溶液,避光放置5h,測吸光度值的變化,實驗結(jié)果見表7。從表7可知,加入葡萄糖、蔗糖、檸檬酸后吸光度值相比對照組有所提高,能增加色素的穩(wěn)定性;加入苯甲酸鈉后吸光度值比對照組略有降低,但降低幅度不是很大,添加適量的苯甲酸鈉基本不影響色素的穩(wěn)定性。
表7 食品添加劑對色素穩(wěn)定性的影響Table 7 Effect of food additives on the stability of the pigment
紅花羊蹄甲花期較長、花量大、色值高,資源極其豐富,是一種很有開發(fā)前景的食用色素品種。采用超聲波輔助提取花色素,最佳的工藝條件為:液料比1∶80,超聲功率120W,鹽酸濃度0.3mol/L,提取時間40min。超聲波法具有工藝簡單,對環(huán)境污染低,成本低等優(yōu)點。但本實驗的工藝條件主要適用于實驗室,中試和大規(guī)模生產(chǎn)工藝條件還有待于進一步研究。
提取得到的紅花羊蹄甲花色素外觀呈紫紅色,水溶性良好。通過羊蹄甲花色素的穩(wěn)定性實驗可知,色素在酸性、低溫、光照條件下穩(wěn)定,K+、Na+、Ca2+、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、苯甲酸鈉存在利于色素穩(wěn)定;但Zn2+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Fe3+、H2O2、Na2SO3影響色素穩(wěn)定性。色素的不穩(wěn)定是許多天然色素普遍存在的問題,如何提高天然色素的穩(wěn)定性是研究者以后應努力的方向,除此之外還應在色素的化學成分、生理活性、毒理學等方面進行全面的研究。
[1]付莉,王麗穎,顧英.南瓜黃色素的提取工藝及其抗氧化性的研究[J].食品工業(yè)科技,2011,32(1):193-194,197.
[2]趙燕燕,崔承彬,蔡兵,等.洋紫荊中化學成分的分離與鑒定[J].中國藥物化學雜志,2004,14(5):294-297.
[3]焦淑清,徐晶瑩.微波萃取紅花羊蹄甲花紅色素的研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(4):190-192.
[4]凌關庭.食品添加劑手冊[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003:1006.
[5]陳杰.紫甘薯色素提取、純化及穩(wěn)定性研究[D].無錫:江南大學,2011:23-29.
[6]凌文華,郭紅輝.植物花色苷[M].北京:科學出版社,2009:57.
[7]張俊杰,王淑霞,周云,等.響應面分析法優(yōu)化米團花黃色素提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2010,31(6):259-210.
[8]宋曉秋,葉琳,楊曉波.紫甘藍色素提取方法研究[J].食品科學,2011,32(8):74-77.
[9]孫希云,劉寧,孟憲軍,等.藍莓多糖超聲波提取及脫蛋白方法[J].食品科學,2010,31(22):134-138.
[10]王鳳潔,沈國良,李良,等.巴旦杏殼天然黃色素提取及其穩(wěn)定性研究[J].南京林業(yè)大學學報:自然科學版,2013,37(1):105-110.
[11]Ankit P,Nigel P,Bruntona C,et al.Effect of thermal processing on anthocyanin stability in foods,mechanisms and kinetics of degradation[J].Trends in Food Science&Technology,2010,21(1):3-11.
[12]王桐,石麗花,陳惠.棗皮中食用色素的提取工藝及其穩(wěn)定性研究[J].中國食品添加劑,2006(5):72-76.
[13]胡迎芬,黃震.女貞果紅色素與金屬離子效應的研究[J].青島大學學報:自然科學版,2002,15(2):22-25.