(上饒師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，江西 上饒 334001)

我國是全球最大的蘋果生產(chǎn)國[1]，蘋果中含有豐富的糖類、維生素、礦物質(zhì)及多酚類物質(zhì)[2]。蘋果中的多酚類物質(zhì)主要是原花色素。原花色素又稱縮合單寧或縮合鞣質(zhì)，由黃烷-3-醇單體縮合而成，也是近年來不斷研究和開發(fā)的一種生物活性物質(zhì)[3-4]。經(jīng)過藥理研究證實原花色素具有抗氧化 、抗癆 、抗突變 、抗真菌 、抗腹瀉、抗過敏及降低毛細血管通透性等多種功能[5-6],在醫(yī)藥、保健品和化妝品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價值[7]。

目前，國內(nèi)外對蘋果原花色素的研究主要集中在原花色素的提取條件[8-10]，而關(guān)于蘋果原花色素分離及其抗氧化作用的文獻較少[11]，特別是采用大孔吸附樹脂分離蘋果原花色素的研究更少[12]。本研究優(yōu)化了蘋果原花色素的提取工藝，并采用大孔吸附樹脂對蘋果原花色素粗提液進行分離，比較分離前后蘋果原花色素對超氧陰離子自由基的清除率，分析分離操作對蘋果原花色素抗氧化作用的影響，為進一步開發(fā)利用蘋果原花色素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

市售紅富士蘋果；兒茶素標準品(≥98%,質(zhì)量分數(shù))；D101、AB-8、HPD100大孔吸附樹脂；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；NL104型電子天平；UV-2102型紫外可見光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘋果原花色素含量測定及提取率計算

以兒茶素標準品為對照，采用香草醛-鹽酸法[13]繪制標準曲線，建立線性回歸方程。根據(jù)標準曲線計算所得的線性回歸方程為：y=2.482 9x+0.020 8(r=0.998 3)，線性范圍為0～0.40 mg/mL。

提取液中蘋果原花色素含量的測定及提取率計算。準確吸取蘋果原花色素提取液1mL，按標準曲線繪制方法操作，測定其吸光度，由線性回歸方程計算提取液中蘋果原花色素含量，并按式(1)計算蘋果原花色素的提取率(%)。

(1)

式中C為提取液中蘋果原花色素的含量(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，W為蘋果質(zhì)量(g)。

1.2.2 蘋果原花色素提取工藝流程

準確稱量去皮蘋果10 g，研磨充分，加入一定體積的乙醇溶液，在一定溫度下回流一定時間，四層紗布過濾，棄渣，濾液用相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容至100 mL，按1.2.1測定其中蘋果原花色素含量，計算蘋果原花色素提取率。

1.2.3 蘋果原花色素提取條件單因素和正交試驗

以蘋果原花色素提取率為參考指標，分別考察乙醇濃度(體積分數(shù)，下同)、料液比、提取時間、提取溫度等因素對蘋果原花色素提取率的影響；再在單因素試驗基礎(chǔ)上進行4因素3水平正交試驗，優(yōu)化蘋果原花色素的提取工藝。每組試驗重復(fù)三次。

1.2.4 三種大孔吸附樹脂對蘋果原花色素靜態(tài)吸附與解吸效果比較

D101、AB-8、HPD100等三種大孔吸附樹脂按文獻[14]進行預(yù)處理。準確稱取三種大孔吸附樹脂各5.0 g于錐形瓶中，分別加入按最佳提取工藝條件提取的蘋果原花色素提取液50 mL，室溫下100 r/min振蕩24 h，過濾，按1.2.1測定濾液中原花色素含量，按式(2)分別計算三種樹脂的吸附率(%)。

將上述三種吸附后的大孔吸附樹脂各四份分別置于錐形瓶中，每種大孔吸附樹脂分別加入25%、50%、75%、100%的乙醇溶液50 mL，室溫下100 r/min振蕩24 h，過濾，按1.2.1測定濾液中原花色素含量，按式(3)分別計算三種樹脂采用不同濃度乙醇溶液解吸的解吸率(%)。每組試驗重復(fù)兩次。

吸附率=(C1V1-C2V2)×100/C1V1

(2)

解吸率=C3V3×100/(C1V1-C2V2)

(3)

式中C1為吸附前提取液中原花色素含量(mg/mL)，C2為吸附后濾液中原花色素含量(mg/mL)，C3為解吸液中原花色素含量(mg/mL)，V1為蘋果原花色素提取液加入量(mL)，V2為吸附后濾液體積(mL)，V3為解吸液體積(mL)。

1.2.5 蘋果原花色素分離前后對超氧陰離子的清除作用

向按最佳提取工藝條件提取的蘋果原花色素提取液和AB-8樹脂吸附后經(jīng)50%乙醇溶液解吸后所得的蘋果原花色素解吸液中分別加入適量蒸餾水，使其原花色素濃度均為0.015 mg/mL。然后按文獻[15]操作，測定經(jīng)適度稀釋后的蘋果原花色素提取液和解吸液對超氧陰離子的清除率。每組試驗重復(fù)兩次。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果原花色素提取條件的優(yōu)化

為了確定蘋果原花色素最佳提取工藝，在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計了四因素三水平正交試驗L9(34)，具體設(shè)計和結(jié)果見表1，極差分析見表2。由表1和表2可知，影響蘋果原花色素提取率的因素主次排序為：乙醇濃度>提取溫度>料液比>提取時間。根據(jù)k值判斷，蘋果原花色素的最佳提取工藝為A2B1C2D2，即乙醇濃度40%、料液比1∶7 g/mL、提取時間80 min、提取溫度60 ℃，在此條件下進行試驗，蘋果原花色素提取率為0.051%，高于所有正交試驗組合的提取率，故確定通過正交試驗優(yōu)化得到的條件為蘋果原花色素的最佳提取工藝條件。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表2 正交試驗極差分析

2.2 三種大孔吸附樹脂對蘋果原花色素靜態(tài)吸附與解吸效果比較

三種大孔吸附樹脂對蘋果原花色素靜態(tài)吸附及不同濃度乙醇溶液靜態(tài)解吸蘋果原花色素的結(jié)果見表3。由表3可知，三種大孔吸附樹脂中AB-8對蘋果原花色素的吸附效果最強，HPD100對蘋果原花色素的吸附效果最弱，但吸附率接近，這可能與原花色素及三種樹脂的極性有關(guān)。原花色素是多酚類化合物，具有較弱的極性；而AB-8樹脂呈弱極性，D101和HPD100為非極性樹脂，三種樹脂極性相近，所以AB-8樹脂對蘋果原花色素的吸附效果最強，但不突出。從解吸效果看，50%乙醇溶液對AB-8樹脂吸附的蘋果原花色素解吸效果最好，解吸率達65.57%?？紤]到樹脂不僅要具有較強的吸附能力，還需要易解吸，因此采用AB-8樹脂對蘋果原花色素提取液中的原花色素進行吸附，然后以50%乙醇溶液進行解吸，解吸液中的蘋果原花色素含量可達0.027 mg/mL。

表3 三種大孔吸附樹脂對蘋果原花色素靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果

2.3 蘋果原花色素分離前后對超氧陰離子的清除作用

蘋果原花色素經(jīng)AB-8樹脂分離前后對超氧陰離子的清除效果見表4。由表4可以看出，兩種溶液中的蘋果原花色素的濃度一致，但0.015 mg/mL的解吸液對超氧陰離子的清除率可達35.21%，較0.015 mg/mL的提取液對超氧陰離子的清除率有大幅度提高。這說明蘋果原花色素提取液經(jīng)過AB-8樹脂分離后，去除了部分雜質(zhì)，減少了雜質(zhì)對蘋果原花色素抗氧化作用的影響，通過分離可以顯著提高蘋果原花色素的抗氧化作用。

表4 蘋果原花色素分離前后對超氧陰離子的清除率

3 結(jié)論

以去皮蘋果為原料，通過試驗確定乙醇溶液提取蘋果原花色素的最佳工藝條件為：乙醇濃度40%、料液比1∶7 g/mL、提取時間80 min、提取溫度60 ℃，在此條件下進行試驗，蘋果原花色素提取率為0.051%。通過極差分析發(fā)現(xiàn)，影響蘋果原花色素提取率的因素主次排序為：乙醇濃度>提取溫度>料液比>提取時間。通過D101、AB-8、HPD100等三種大孔吸附樹脂對蘋果原花色素進行靜態(tài)吸附及采用不同濃度乙醇溶液進行靜態(tài)解吸的比較，發(fā)現(xiàn)AB-8樹脂對蘋果原花色素提取液中的原花色素吸附效果最好，吸附率達79.36%；然后以50%乙醇溶液進行解吸，解吸率可達65.57%，解吸液中的蘋果原花色素含量可達0.027 mg/mL。此外，通過測定0.015 mg/mL的蘋果原花色素解吸液和蘋果原花色素提取液對超氧陰離子的清除率發(fā)現(xiàn)，0.015 mg/mL的蘋果原花色素解吸液對超氧陰離子的清除率可達35.21%，清除效果較蘋果原花色素提取液明顯提高，說明通過分離可以加強蘋果原花色素的抗氧化作用。