任 杰，胡志和，吳子健，薛 璐

（天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

IgG是一類具有良好的免疫保護(hù)功能和生物活性物質(zhì)的球蛋白，是牛初乳中最引人注目的功能因子，也是牛初乳中最重要的免疫因子[1-2]。在人類歷史上，利用非免疫牛生產(chǎn)的初乳來預(yù)防和治療人類疾病，已有幾個世紀(jì)的歷史。雖然IgG的含量在整個泌乳期分布非常不均衡[3]，但是在初乳中含量特別高，占免疫球蛋白總量的80%～90%[4-5]。醫(yī)學(xué)和臨床研究均表明，IgG是系統(tǒng)免疫的產(chǎn)物，主要由脾臟和淋巴結(jié)中的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化發(fā)展成的漿細(xì)胞產(chǎn)生并進(jìn)入血液，然后通過乳腺組織中的主動轉(zhuǎn)移機(jī)制到達(dá)牛乳之中[6]。通過初乳的傳遞，IgG可以使那些自身免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育健全的新生仔畜免受外來疾病的侵襲，特別是對腸道疾病和腸道微生物的侵襲提供了局部保護(hù)作用[7-8]。相比于其他類的免疫球蛋白，IgG更易擴(kuò)散到血管外的間隙內(nèi)，因而在結(jié)合補(bǔ)體、增強(qiáng)免疫細(xì)胞吞噬病原微生物以及中和細(xì)菌毒素等方面能更加有效地發(fā)揮作用，抵抗外部的感染[9]。目前，作為一種生物活性蛋白質(zhì)的IgG，常常被添加到乳制品中，以其含量為決定產(chǎn)品質(zhì)量和價(jià)格的標(biāo)準(zhǔn)[10]；在不同加工處理工藝對產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值影響的評價(jià)中，其含量又可作為活性蛋白質(zhì)保留或損失程度的指標(biāo)[11]；在大多數(shù)的牛初乳及具有免疫功能的乳制品開發(fā)和加工過程中，都會對其質(zhì)量濃度進(jìn)行檢測[12-13]。

IgG的檢測方法有多種，主要有分離層析法、電泳法、免疫學(xué)法和物理法等[14]，其中酶聯(lián)免疫法檢測牛初乳中的IgG活性，檢測結(jié)果快速、準(zhǔn)確，靈敏度高[15-16]。本實(shí)驗(yàn)從探討牛初乳營養(yǎng)價(jià)值的角度出發(fā)，研究不同的超高壓處理?xiàng)l件對牛初乳中IgG活性的影響，采用酶聯(lián)免疫法對其進(jìn)行檢測，為牛初乳制品的研究和開發(fā)提供了科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛初乳（產(chǎn)犢48h內(nèi)） 由天津市武清區(qū)德興隆奶業(yè)有限公司提供；NaCl等生化試劑 分析純級，天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；ELISA檢測試劑盒 牛免疫球蛋白G（IgG）酶聯(lián)免疫試劑盒，購自深圳慧嘉生物科技有限公司；試劑盒包括封板膜、密封袋、用純化的抗原包被的ELISA反應(yīng)板、標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、樣品稀釋液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗原、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、濃縮洗滌液。

HPP.L3-600/0.6超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；RT-6000酶標(biāo)分析儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；VELP漩渦振蕩器 德祥科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；塑料薄膜封口機(jī) 浙江江南實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 樣品的超高壓處理

量取5mL左右的生鮮牛初乳裝于聚乙烯塑料袋內(nèi)，真空密封后進(jìn)行超高壓處理，將處理后的牛初乳稀釋一定倍數(shù)后待用，檢測樣品中IgG的活性。其中，對照組樣品為常壓下的牛初乳。

1.2.1 壓力大小對牛初乳中IgG的影響 施壓溫度維持在30℃，保壓時(shí)間為20min，分別選取0.1、100、200、300、400、500、600MPa的壓力條件處理牛初乳，依照IgG的活性檢測方法，在450nm下測得樣品的吸光度值，計(jì)算樣品的活性提高率。

1.2.2 施壓溫度對牛初乳中IgG的影響 在處理壓力為350MPa，保壓時(shí)間為20min，分別選取20、25、30、35、40℃的溫度條件處理牛初乳，依照IgG的活性檢測方法，在450nm下測得的吸光度值，計(jì)算樣品的活性提高率。

1.2.3 保壓時(shí)間對牛初乳中IgG的影響 在處理壓力為350MPa，施壓溫度為30℃，分別選取0、10、20、30、40、50、60min的保壓時(shí)間處理牛初乳，依照IgG的活性檢測方法，在450nm下測得樣品的吸光度值，計(jì)算樣品的活性提高率。

1.2.4 超高壓處理對牛初乳中IgG活性影響的條件優(yōu)化 選用處理壓力、施壓溫度和保壓時(shí)間作為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)L9（33），選取樣品處理后活性提高較大的壓力、溫度和時(shí)間組合。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9（33）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1Factors and levels table of L9（33）orthogonal experiment

1.3 IgG的活性檢測

1.3.1 IgG標(biāo)準(zhǔn)品的檢測 在用純化的抗原包被的ELISA反應(yīng)板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔，按順序加入標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，稀釋后各孔加樣量為50μL，濃度分別為24、16、8、4、2μg/mL，每個溶度均設(shè)置三個平行。根據(jù)酶標(biāo)儀讀出OD450nm值，以IgG的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制不同質(zhì)量濃度的IgG標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 牛初乳中IgG活性的檢測 在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，然后再加稀釋100倍后的待測樣品10μL，封板后37℃溫育30min，板清洗5次（每次清洗時(shí)，每個孔都加滿洗滌液，然后靜置30s，倒掉洗滌液后用力拍干），加50μL酶標(biāo)試劑至每個孔，空白孔除外，再次封板，37℃溫育30min，板再次清洗5次（同上）。結(jié)束后，每個孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，混勻后37℃避光顯色15min，加50μL終止液至每個孔以終止反應(yīng)，將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中于450nm下測定吸光度值。每個樣品平行測定三次，取平均值。樣品最終的稀釋度為500倍。

1.4 活性提高率的計(jì)算

計(jì)算公式如下：

活性提高率（%）=（超高壓處理后樣品的IgG含量-對照組樣品的IgG含量）/對照組樣品的IgG含量×100

式中：對照組樣品在0.1MPa下處理。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析和圖表制作利用軟件Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.3.1方法進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示。

圖1 ELISA試劑盒測定牛初乳中IgG的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of determination of immunoglobulin G in bovine colostrum by ELISA Kit

由圖1可見，經(jīng)ELISA試劑盒測定牛初乳中IgG的吸光度值，所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0769x-0.0351，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9986，說明在所測的濃度的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性較好。

2.2 壓力大小對牛初乳中IgG的影響

圖2 壓力對牛初乳中IgG的影響Fig.2 Effect of pressure on immunoglobulin G of bovine coloctrum

由圖2可以看出，與常壓下的對照組相比，經(jīng)過超高壓處理后，IgG的活性明顯提高。當(dāng)壓力從常壓逐漸升高到200MPa時(shí)，隨著壓力的增大，IgG的活性也隨之增大。其中在200MPa時(shí)，牛初乳中IgG的含量值為4.9441mg/mL，與常壓下IgG含量值為2.7445mg/mL相比，活性提高率為80.15%，在所測的壓力范圍內(nèi)，達(dá)到最大值。當(dāng)壓力從200MPa繼續(xù)上升至600MPa時(shí)，隨著壓力升高，牛初乳中IgG活性的增加量減小，活性提高率雖然呈現(xiàn)出下降的趨勢，但變化平緩，即使在600MPa時(shí)，牛初乳中IgG的含量值為4.5501mg/mL，與對照組比較，活性提高率為65.79%。

2.3 施壓溫度對牛初乳中IgG的影響

圖3 溫度對牛初乳中IgG的影響Fig.3 Effect of temperature on immunoglobulin G of bovine coloctrum

由圖3可以看出，經(jīng)過超高壓處理以后，與常壓下的對照組相比，牛初乳中IgG的活性均增大，而且IgG的活性變化與超高壓處理的溫度有很大的關(guān)系。在20～25℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，牛初乳中IgG活性的增加量減少，當(dāng)施壓溫度為25℃時(shí)，樣品中IgG的含量值為4.3329mg/mL，常壓下樣品中IgG的含量值為2.7464mg/mL，活性提高率為57.77%。在所測溫度范圍內(nèi)，25℃時(shí)活性增加量最小。繼續(xù)升高溫度，在25℃到40℃這段溫度范圍內(nèi)，IgG的活性隨著溫度的升高而增大。尤其是在25～35℃之間，活性變化曲線近似為線性關(guān)系，上升趨勢明顯，而從35～40℃的溫度變化范圍內(nèi)，曲線逐漸趨于平緩。其中，在35℃時(shí)牛初乳中IgG的含量值為5.0364mg/mL，活性提高率為83.38%，40℃時(shí)測得IgG的含量值為5.1222mg/mL，活性提高率為86.51%。

2.4 保壓時(shí)間對牛初乳中IgG的影響

圖4 時(shí)間對牛初乳中IgG的影響Fig.4 Effect of time on immunoglobulin G of bovine coloctrum

圖4顯示，牛初乳中的IgG經(jīng)過超高壓處理以后活性明顯提高，而且在所測時(shí)間范圍內(nèi)，IgG的活性隨著保壓時(shí)間的延長而逐漸增大。當(dāng)保壓時(shí)間在0～30min時(shí)，活性變化率曲線直線上升，活性增加較大；常壓下測得牛初乳中IgG的含量值為2.7445mg/mL，而保壓時(shí)間為30min時(shí)，測得牛初乳中IgG的含量值為4.9096mg/mL，與對照組相比，活性提高率為78.89%。當(dāng)保壓時(shí)間在30～60min范圍內(nèi)時(shí)，活性隨著保壓時(shí)間的延長繼續(xù)增大，但提高率曲線的增幅減小，上升的趨勢變得平緩。當(dāng)保壓時(shí)間達(dá)到了60min時(shí)，測得牛初乳中IgG的含量值為5.1651mg/mL，與對照組相比，活性提高率為88.20%，但與保壓時(shí)間為30min相比，IgG的活性提高率僅改變了9.31%，說明保壓時(shí)間在30～60min時(shí)間范圍內(nèi)，延長保壓時(shí)間對IgG的活性影響不大。

2.5 超高壓處理對牛初乳中IgG活性影響的條件優(yōu)化

表2 L9（33）條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The test results of optimization

由正交表分析k值可得，三個因素中均為第2個水平的數(shù)值最高，最優(yōu)組合為A2B2C2，即為500MPa、35℃、20min；由極差分析結(jié)果可知：RA＞RC＞RB，因此上述三種影響因子對牛初乳中IgG活性的作用大小順序?yàn)閴簭?qiáng)、時(shí)間、溫度。

根據(jù)優(yōu)化條件進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，IgG活性的OD450nm值為0.8367，活性提高率為105.08%。該檢測結(jié)果與正交表中第5組組合（500MPa，35℃，25min）結(jié)果（106.42%）相比，提高率相近，無顯著差異，所存在差異可能為檢測誤差。因此，優(yōu)化條件為500MPa、35℃、20min，在該條件下處理牛初乳，其IgG活性將大幅提高。

3 討論

IgG分子是由通過兩個二硫鍵（-S-S-）相連接的兩條輕鏈（L鏈）和兩條重鏈（H鏈）所組成[17]，其結(jié)構(gòu)區(qū)域又可分為位于C端的穩(wěn)定區(qū)（C區(qū)）和位于N端的可變區(qū)（V區(qū)），其中可變區(qū)域是由輕鏈和重鏈末端所組成的，又可分為超變區(qū)（HVR）和骨架區(qū)，抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的位置就是在此超變區(qū)域，通過改變超變區(qū)域段的結(jié)構(gòu)形狀從而實(shí)現(xiàn)對不同抗原的識別作用，達(dá)到被動或主動免疫的目的[18]。

Masuda T等[19]采用SDS凝膠電泳檢測牛初乳中的免疫球蛋白的研究表明：IgG對高壓處理具有抵抗性，在室溫條件下、保壓時(shí)間為10min，當(dāng)施加壓強(qiáng)小于400MPa時(shí)，免疫球蛋白幾乎沒有影響。Felipe X等[20]研究表明，免疫球蛋白即使在壓力為500MPa、溫度為25℃的條件下都不會發(fā)生變性，只有更高的壓力和溫度才會導(dǎo)致其發(fā)生變性。張和平等[21]采用熒光分光光度計(jì)法在284nm激發(fā)波長條件下溶液的最大發(fā)射波長和熒光強(qiáng)度來檢測IgG，其中IgG的處理壓強(qiáng)為200～700MPa、保壓時(shí)間為20min、施壓溫度為室溫，研究表明，其他物質(zhì)如蔗糖的存在對IgG發(fā)生變性具有保護(hù)作用，而且物質(zhì)的濃度越大，IgG在高壓下的穩(wěn)定性越好。

程金波等[22]采用不同的加熱方式處理牛奶，通過雙抗體夾心法ELISA方法檢測乳中IgG的含量，結(jié)果顯示，乳品工業(yè)中常用的巴氏殺菌對于牛乳中的IgG影響并不大，在63℃的條件下處理30min，IgG的活性幾乎不受任何影響，即使在75℃溫度下處理15s，乳中IgG的變性率也僅約為9.3%。Indyk HE等[23]采用光學(xué)生物傳感器免疫測定技術(shù)，利用同步檢測牛體內(nèi)抗IgG的抗體和蛋白質(zhì)G的含量來檢測IgG的活性，研究發(fā)現(xiàn)，IgG在溫度高于60℃時(shí)才表現(xiàn)出對熱不穩(wěn)定的狀態(tài)。岳喜慶等[24]在研究牛初乳免疫球蛋白體外穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)中觀察到，牛初乳免疫球蛋白在低于65℃的范圍內(nèi)具有較高的熱穩(wěn)定性，其中，他是采用瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法檢測牛初乳中免疫球蛋白。趙玉娟[25]采用硫酸銨鹽析法分離提取出免疫球蛋白，繼而采用試管凝集法測其含量，研究證實(shí)，在溫度低于60℃時(shí)，免疫球蛋白的穩(wěn)定性較好。

4 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，牛初乳經(jīng)過超高壓處理后，在優(yōu)化條件（壓強(qiáng)為500MPa、施壓溫度為35℃、保壓時(shí)間為20min）下處理牛初乳，其IgG的活性有很大提高。Indyk HE等[23]研究還表明，溫和的熱處理和加壓處理對牛初乳中的IgG活性具有促進(jìn)作用。這與本實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果一致。無論是升高溫度、壓強(qiáng)，還是延長保壓時(shí)間，牛初乳中IgG的含量均呈增加的趨勢，這是因?yàn)槌邏禾幚砀淖兞薎gG的分子結(jié)構(gòu)，可變區(qū)域的結(jié)構(gòu)形狀也隨之發(fā)生變化，使之更易與抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，或與之結(jié)合的更加緊密，導(dǎo)致了吸光度的增加，活性的增強(qiáng)。因此，適當(dāng)?shù)母邏禾幚砀纳屏嗣庖咔虻鞍椎幕钚?，提高了牛初乳的免疫功能?/p>

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