李金星，胡志和，2，*，馬立志，雷 穎，經(jīng) 典

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134；2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；3.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550005）

藍(lán)莓（blueberry）又稱(chēng)越橘、藍(lán)漿果，杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium spp.）多年生落葉或常綠灌木，果實(shí)為漿果，近圓形，呈藍(lán)色，酸甜適度，果肉細(xì)膩，皮薄籽小[1-2]。藍(lán)莓是越橘屬植物中營(yíng)養(yǎng)成分最豐富的種類(lèi)，除含常規(guī)的有機(jī)酸、糖以外，還富含的多種維生素、超氧化物歧化酶（SOD）、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)等成分，以及花色苷、黃酮、尼克酸等特殊成分[3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓不僅具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還具有多種生理功能[4-7]。因此，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為人類(lèi)五大健康食品之一[8]。藍(lán)莓除了鮮食之外，一般加工成果漿﹑果汁或濃縮汁。在藍(lán)莓加工過(guò)程中，很多生物活性成分殘留在皮渣中，尤其是花色苷的含量特別高[9]。

花色苷是一類(lèi)廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類(lèi)化合物[10]。與合成色素相比，具有安全性高、資源豐富且具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用等優(yōu)點(diǎn)[11]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)食品安全和自身健康的重視，花色苷已經(jīng)越來(lái)越受到消費(fèi)者和研究者的關(guān)注。

超聲波輔助技術(shù)是一項(xiàng)新型的天然產(chǎn)物輔助溶劑提取技術(shù)，它利用超聲波的機(jī)械作用、空化作用、熱效應(yīng)等加速提取物的有效溶出，縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率，同時(shí)避免了高溫對(duì)提取物質(zhì)的影響[12-13]。本研究以藍(lán)莓果渣為原料，同時(shí)應(yīng)用超聲波對(duì)花色苷進(jìn)行輔助提取，以期為充分利用藍(lán)莓資源，提高花色苷的提取效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓凍果（北陸） 北京東方夏都樹(shù)莓科技發(fā)展有限公司；果膠酶（純度＞98%，40000μ/g） 天津昊斯生物科技有限公司；甲醇、乙醇、丙酮、氯化鉀、乙酸鈉、鹽酸 均為分析純，天津昊斯生物技術(shù)有限公司。

KQ－500DE型數(shù)控超聲波清洗器（頻率40kHz）昆山市超聲儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；6202型高速粉碎機(jī) 北京環(huán)亞天元機(jī)械技術(shù)有限公司；FD－2型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L535－1型低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU－1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 稱(chēng)取一定量藍(lán)莓進(jìn)行解凍破碎，按照果膠酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.06%、酶解溫度為35℃、酶解時(shí)間為2.5h處理后進(jìn)行榨汁，100℃滅酶30min后離心（4000r/min）10min，取榨汁后的藍(lán)莓果渣，冷凍干燥后烘干至恒重，粉碎成粉末，備用。

1.2.2 藍(lán)莓果渣花色苷最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g藍(lán)莓果渣粉末，以體積分?jǐn)?shù)為60%的酸性乙醇（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5）為溶劑，料液比為1∶50g/mL，40℃下超聲波功率500W提取40min，提取一次，將提取液過(guò)濾，取濾液稀釋20倍，測(cè)定藍(lán)莓果渣花色苷的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.3 花色苷提取量的計(jì)算 將藍(lán)莓果渣粉末進(jìn)行提取后，測(cè)定提取液的吸光值，參考楊兆艷[14]的公式并進(jìn)行改良，計(jì)算花色苷提取量。

花色苷提取量（mg/g）=（A/εL）×MW×DF×V/Wt

式中：A─吸光度，A=（A520nmpH1.0－A700nmpH1.0）－（A520nmpH4.5－A700nmpH4.5）；ε─矢車(chē)菊花素－3－葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900；L─光程，1cm；MW─矢車(chē)菊花素－3－葡萄糖苷的分子量，449.2；DF─稀釋因子；V─最終體積，mL；Wt─產(chǎn)品重量，mg。

1.2.4 提取溶劑的選擇 準(zhǔn)確稱(chēng)取4份1g的果渣粉末，分別以體積分?jǐn)?shù)為60%的酸性甲醇（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5）、酸性乙醇（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5）、酸性丙酮（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5）、酸水（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5）為溶劑，按料液比1∶50g/mL，提取溫度40℃，超聲波功率500W，提取時(shí)間40min進(jìn)行提取，提取一次，將提取液過(guò)濾，測(cè)定花色苷提取量，確定最佳提取溶劑。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 提取溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量的影響分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1g的果渣粉末，選取料液比為1∶50g/mL，超聲波功率為500W，提取溫度為40℃，提取時(shí)間為40min，分別采用體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的酸性乙醇（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5）為提取溶劑進(jìn)行提取。提取一次，將提取液過(guò)濾，測(cè)定花色苷提取量，確定較好的提取溶劑體積分?jǐn)?shù)。

1.2.5.2 料液比對(duì)花色苷提取量的影響 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1g的果渣粉末，選取體積分?jǐn)?shù)為60%的酸性乙醇（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5），超聲波功率為500W，溫度為40℃，提取時(shí)間為40min，分別采用1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90g/mL為料液比進(jìn)行提取。提取一次，將提取液過(guò)濾，測(cè)定花色苷提取量，確定較好的料液比。

1.2.5.3 提取溫度對(duì)花色苷提取量的影響 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5份1g的果渣粉末，選取體積分?jǐn)?shù)為60%的酸性乙醇（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5），料液比為1∶50g/mL，超聲波功率為500W，提取時(shí)間為40min，分別采用20、30、40、50、60℃為提取溫度進(jìn)行提取。提取一次，將提取液過(guò)濾，測(cè)定花色苷提取量，確定較好的提取溫度。

1.2.5.4 提取時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取6份1g的果渣粉末，選取體積分?jǐn)?shù)為60%的酸性乙醇（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5），料液比為1∶50g/mL，超聲波功率為500W，溫度為40℃，分別采用10、20、30、40、50、60min為提取時(shí)間進(jìn)行提取，提取一次。將提取液過(guò)濾，測(cè)定花色苷提取量，確定較好的提取時(shí)間。

1.2.5.5 提取功率對(duì)花色苷提取量的影響 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取7份1g的果渣粉末，選取體積分?jǐn)?shù)為60%的酸性乙醇（HCl體積分?jǐn)?shù)為1%；pH=1.5），料液比為1∶50g/mL，溫度為40℃，提取時(shí)間為40min，分別采用200、250、300、350、400、450、500W為提取功率進(jìn)行提取。提取一次，將提取液過(guò)濾，測(cè)定花色苷提取量，確定較好的提取功率。

1.2.6 最佳提取條件的確定 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取功率為主要影響因素，設(shè)計(jì)5因素4水平正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，每組實(shí)驗(yàn)提取一次，以花色苷提取量為考察指標(biāo)，確定超聲波輔助提取藍(lán)莓果渣中花色苷的最佳工藝條件。

1.2.7 最佳提取次數(shù)的確定 在單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取條件下，對(duì)藍(lán)莓果渣粉進(jìn)行提取，過(guò)濾得到濾液I，濾渣在最佳提取條件下進(jìn)行二次提取，過(guò)濾得濾液Ⅱ，采取相同的操作分別得濾液Ⅲ，Ⅳ…n…N，以花色苷的提取量作為考察指標(biāo)。

1.2.8 與酸性乙醇浸提法的比較實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g藍(lán)莓果渣粉末，選取超聲波功率0W，提取時(shí)間120min，其他條件采用超聲波輔助提取確定的最佳條件進(jìn)行提取，將提取液過(guò)濾，測(cè)定花色苷提取量。與超聲波輔助提取進(jìn)行比較。

表1 L16（45）因素水平表Table 1Factor－level design L16（45）

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，分別平行取樣，結(jié)果以平均值計(jì)算。用Microsoft Excel 2003軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓果渣花色苷的紫外可見(jiàn)吸收光譜

圖1 藍(lán)莓果渣提取液的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectra of blueberry pomace extracts

由于花色苷所帶的基團(tuán)不同，可能會(huì)有以下幾個(gè)特征吸收峰：一個(gè)位于可見(jiàn)光區(qū)的500～540nm之間，另一個(gè)位于紫外光區(qū)275nm附近；另外，如果花色苷存在酰基化，則在紫外區(qū)300～330nm處也存在特征吸收峰[15]。由圖1可見(jiàn)，藍(lán)莓果渣提取液分別在520、330、以及280nm處出現(xiàn)吸收峰，這與花色苷的特征吸收峰相符，表明藍(lán)莓果渣提取液中含有花色苷類(lèi)物質(zhì)。提取液在330nm處出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明花色苷?；容^多，芳香基團(tuán)多。

2.2 提取溶劑的選擇

花色苷是水溶性多酚類(lèi)物質(zhì)，可溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑中?；ㄉ赵谌跛嵝詶l件下穩(wěn)定，中性和弱堿性條件下不穩(wěn)定，因此，通常選用酸性溶劑進(jìn)行提取。由圖2可知，酸性乙醇提取效果最好，花色苷提取量為8.42mg/g，酸性甲醇次之，酸性水溶液對(duì)藍(lán)莓果渣的提取效果最差，提取量?jī)H為5.78mg/g。因此本實(shí)驗(yàn)選擇酸性乙醇作為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對(duì)花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of different extraction solvents on the yield of anthocyanins

2.3 酸性乙醇為溶劑提取皮渣中花色苷的條件優(yōu)化

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量的影響 由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，花色苷的提取量逐漸升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)達(dá)到最大，花色苷提取量為8.55mg/g，但是乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，花色苷的提取量反而逐漸降低。這可能是因?yàn)樵谝掖俭w積分?jǐn)?shù)較低的體系中，一些水溶性好的物質(zhì)影響了花色苷的溶出，導(dǎo)致提取效果差；在乙醇體積分?jǐn)?shù)較高的體系中，花色苷能較好地溶解，而其他物質(zhì)則不易溶出，因此花色苷提取效果較好。但是，乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高，脂溶性成分溶出增加，造成提取效果變差[16]。因此選擇60%為提取最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanins

2.3.2 料液比對(duì)花色苷提取量的影響 由圖4可知，隨著料液比的增大，花色苷提取量逐漸增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶50g/mL時(shí)提取量達(dá)到最大，花色苷提取量為8.42mg/g，料液比繼續(xù)增加，提取量變化不明顯。這可能是因?yàn)榱弦罕鹊脑黾幽茉龃蠊桃簝上嗷ㄉ盏臐舛炔?，有利于花色苷的溶出，從而提高提取量[17]。因此選擇1∶50g/mL為提取最佳料液比。

圖4 料液比對(duì)花色苷提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanins

2.3.3 提取溫度對(duì)花色苷提取量的影響 由圖5可知，隨著提取溫度的升高，花色苷提取量逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)達(dá)到最大，花色苷提取量為8.68mg/g，溫度繼續(xù)增加，花色苷的提取量反而下降。這可能是因?yàn)樘崛囟鹊纳哂欣诨ㄉ盏娜艹?，提取量增加。但溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致花色苷降解或結(jié)構(gòu)變化，使提取量或檢測(cè)值降低[18]。因此選擇40℃為提取最佳溫度。

圖5 提取溫度對(duì)花色苷提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of anthocyanins

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響 由圖6可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷的提取量逐漸增加，提取時(shí)間為40min時(shí)達(dá)到最大，花色苷提取量為8.58mg/g；提取時(shí)間繼續(xù)增加，花色苷的提取量反而降低。這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷逐漸溶出，提取量增加；提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，可能會(huì)影響花色苷的穩(wěn)定性，使其部分降解，提取量下降[19]。因此選擇40min為提取最佳時(shí)間。

圖6 提取時(shí)間對(duì)花色苷提取量的影響Fig.6 Effect of extraction time on the yield of anthocyanins

2.3.5 提取功率對(duì)花色苷提取量的影響 由圖7可知，隨著提取功率的增加，花色苷的提取量逐漸增加，功率達(dá)到350W左右時(shí)提取量達(dá)到最大，花色苷提取量為8.73mg/g，之后提取功率繼續(xù)增加，花色苷提取量逐漸減少。這可能是因?yàn)槌暡ǖ奈锢砑羟凶饔煤涂栈饔每梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)破壞藍(lán)莓果渣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使花色苷迅速有效溶出，使提取量增加。但是提取功率過(guò)高，會(huì)破壞花色苷的穩(wěn)定性，使花色苷提取量減少[20]。

圖7 提取功率對(duì)花色苷提取量的影響Fig.7 Effect of extraction power on the yield of anthocyanins

2.3.6 最佳提取條件的確定 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)，選取提取溶劑體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取功率，按照正交表L16（45）進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 L16（45）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，16組實(shí)驗(yàn)中超聲波輔助提取花色苷的最優(yōu)條件組合為A2B3C4D1E2，即超聲波功率為350W，提取溫度為45℃，提取時(shí)間為50min，料液比為1∶45g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取一次。在此條件下花色苷的提取量為（8.8±0.05）mg/g。

極差R值分析結(jié)果表明，各因素對(duì)花色苷提取量的影響次序?yàn)镋＞D＞B＞A＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取溫度＞超聲波功率＞提取時(shí)間。分析k值可知，最優(yōu)組合為A2B3C4D3E2，即超聲波功率為350W，提取溫度為45℃，提取時(shí)間為50min，料液比為1∶55g/mL，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，提取一次。由于此組合未出現(xiàn)在正交實(shí)驗(yàn)的組合之內(nèi)，按此條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次，花色苷提取量為（9.01±0.03）mg/g，優(yōu)于直觀分析的最佳組合，說(shuō)明分析結(jié)果正確可靠。

2.4 提取次數(shù)的確定

按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的條件對(duì)藍(lán)莓果渣進(jìn)行多次提取，結(jié)果如圖8所示，提取兩次的花色苷總量（9.91±0.05mg/g）與提取三次的花色苷總量（10.09±0.03mg/g）相差甚小，且提取兩次的花色苷含量基本達(dá)到穩(wěn)定，綜合提取成本、提取量和提取效率等因素，從藍(lán)莓果渣中提取花色苷時(shí)提取2次即可。

圖8 提取次數(shù)對(duì)花色苷提取量的影響Fig.8 Effect of Extraction times on the yield of anthocyanin

2.5 與酸性乙醇浸提法的比較實(shí)驗(yàn)

按1.2.8對(duì)藍(lán)莓果渣進(jìn)行酸性乙醇浸提，在此條件下花色苷的提取量為（8.34±0.03）mg/g。在提取溫度、乙醇濃度、物料比、提取次數(shù)等條件相同的情況下，超聲波輔助提取花色苷的量為（9.91±0.05）mg/g，比酸性乙醇浸提法所得到的花色苷含量提高18.8%。與酸性乙醇浸提法相比，超聲波輔助提取能大大縮短提取時(shí)間，提高提取量。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，得出各因素對(duì)花色苷提取量的影響次序：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞提取溫度＞超聲波功率＞提取時(shí)間。

超聲波輔助提取花色苷的最優(yōu)工藝條件為：超聲波功率350W，提取溫度45℃，提取時(shí)間50min，料液比1∶55g/mL，乙醇（pH=1.5）體積分?jǐn)?shù)60%，提取2次，在此條件下花色苷提取量為（9.91±0.05）mg/g。酸性乙醇浸提法采用超聲波功率0W，提取時(shí)間120min，其他條件采用超聲波輔助提取確定的最佳條件對(duì)花色苷進(jìn)行提取，花色苷提取量為（8.34±0.03）mg/g。

綜上可知，與酸性乙醇浸提法相比，超聲波輔助提取藍(lán)莓果渣中的花色苷，提取時(shí)間短，提取量大，提高了提取效率。

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