陳況況，章宏慧，劉東紅，葉興乾，陳健初

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058）

水芹（Oenanthe Javanica）為傘形科植物，分布于河南、江西、江蘇、安徽、浙江、湖北、廣東、湖南、四川、廣西、臺灣等地，是我國傳統(tǒng)特色水生蔬菜的重要種類。水芹含有多種氨基酸、揮發(fā)油及黃酮類化合物，其中黃酮類物質(zhì)含量很高，具有降血壓、降血脂、保護(hù)心血管和增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用[1]。有關(guān)文獻(xiàn)研究了從水芹中提取黃酮類物質(zhì)的方法和工藝條件，主要以有機(jī)溶劑加熱回流提取為主[2-3]。但有機(jī)溶劑提取出來的不僅有黃酮類物質(zhì)還有大量的糖類蛋白色素等雜質(zhì)，影響了對其黃酮類物質(zhì)生理活性的進(jìn)一步研究。大孔樹脂是近10年來發(fā)展起來的一類有機(jī)高分子聚合物吸附劑，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于酸堿及有機(jī)溶劑，不受無機(jī)鹽類及強(qiáng)離子、低分子化合物的干擾，吸附效果好，再生簡便，使用周期長，被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化[4]。大孔樹脂可以通過靜電吸附力，氫鍵結(jié)合作用，絡(luò)合作用和分子篩的作用選擇性吸附水溶液或非水溶劑體系的目標(biāo)成分[5]。很多文獻(xiàn)研究了大孔樹脂純化黃酮化合物的工藝、熱力學(xué)及動(dòng)力學(xué)方程，對吸附和解吸過程中的物理變化進(jìn)行了闡釋[6-8]。本文選用6種不同的大孔樹脂對水芹粗黃酮進(jìn)行靜態(tài)吸附并進(jìn)行篩選，探討了動(dòng)態(tài)吸附的最優(yōu)工藝條件，為水芹黃酮的富集純化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水芹（Oenanthe javanica（Bl.）DC） 購于浙江省杭州市上城區(qū)近江水產(chǎn)農(nóng)副產(chǎn)品綜合市場農(nóng)貿(mào)市場；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁、槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-L-鼠李糖苷、山奈酚 美國Sigma公司；乙腈 色譜純，美國tedia公司；AB-8、ADS-17、NKA-9、NKA、D101、X-5六種大孔樹脂 河北滄州寶恩公司，該公司生產(chǎn)的六種大孔樹脂的型號和特性見表1。

UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；水浴搖床 江蘇金壇億通電子有限公司；BCW203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；層析柱 內(nèi)徑×長度=26mm×30cm，容積150mL（1BV=150mL），上海嘉鵬科技有限公司；Agilent SBC18色譜柱（4.6×250mm，5μm），Waters e2695型高效液相色譜儀。

表1 六種大孔樹脂的型號和特性Table 1 Property of six types of macroporous resin

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水芹黃酮的提取 參照劉恒蔚[9]和毛飛[10]的方法并加以修改，將新鮮水芹于鼓風(fēng)干燥箱中于60℃下烘干，粉碎過25目篩，稱取100g水芹干粉，以70%乙醇水浴加熱回流2.5h，加熱溫度為73℃，抽濾得到水芹黃酮提取液。

1.2.2 總黃酮含量的測定 總黃酮含量的測定參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取蘆丁21mg，用80%乙醇定容至100mL備用，取7只具塞試管，分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，用80%乙醇補(bǔ)足體積至5mL，混勻，各加入0.3mL 5%NaNO2，混勻后靜置5min，加0.3mL 10%Al（NO3）3混勻后靜置6min，加入4mL 1mol/L NaOH，再加入0.4mL 80%乙醇使體積為10mL，混勻后靜置10min，于510nm下測定吸光值。以測定結(jié)果制得吸光度與蘆丁濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.226X+0.007（X：濃度，mg/mL；Y：吸光值），R2=0.999。

1.2.2.2 水芹黃酮溶液中黃酮含量的測定 準(zhǔn)確吸取樣品液1.00mL置于10mL具塞試管中，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度，由吸光度根據(jù)回歸方程計(jì)算出質(zhì)量濃度。

1.2.3 樹脂的預(yù)處理 將六種大孔吸附樹脂AB-8、X-5、NKA、NKA-9、ADS-17、D101分別在95%乙醇中浸泡24h，并不時(shí)用玻璃棒攪拌，使樹脂和乙醇充分接觸，以便從孔中趕出空氣。濕法裝柱，用蒸餾水洗凈乙醇，然后用2BV 5%NaOH溶液沖洗，再用蒸餾水沖洗至中性，之后用2BV 5%的鹽酸沖洗樹脂，最后用蒸餾水沖至中性。處理完畢后裝入燒杯中用蒸餾水浸泡，用時(shí)取適量即可[12]。

1.2.4 靜態(tài)吸附量、吸附率及解吸率的測定 準(zhǔn)確稱取已處理好的大孔樹脂0.5g，置于三角瓶中，加入一定濃度的黃酮提取液10mL，室溫下振蕩24h至吸附平衡，過濾，測總黃酮濃度[13]。

式中，Q為靜態(tài)吸附量，mg/g；C0為初始濃度，mg/mL；Cv為剩余濃度，mg/mL；V1為黃酮提取液體積，mL；W為樹脂質(zhì)量，g。

取吸附飽和的大孔樹脂用蒸餾水洗至洗脫液無色，過濾，吸干表面水分，加入90%乙醇30mL，室溫下振蕩12h，將樹脂濾出，測定濾液中總黃酮濃度。

式中，Cd為解吸液濃度，mg/mL；V2為解吸液體積，mL；V1為黃酮提取液體積，mL。

1.2.5 樹脂富集能力的評價(jià) 樹脂富集能力的評價(jià)參照文獻(xiàn)[14]，純化后樣品中黃酮含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與純化前樣品中黃酮含量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之比為樹脂對該黃酮粗提物的富集能力。

式中，M1為樣品中黃酮質(zhì)量，mg；M2為樣品質(zhì)量，g。

式中，M3為產(chǎn)品中黃酮質(zhì)量，mg；M4為產(chǎn)品質(zhì)量，g。

富集倍數(shù)=經(jīng)大孔樹脂富集后產(chǎn)品純度/上柱純化前水芹粗黃酮樣品純度。

1.2.6 動(dòng)態(tài)吸附上樣速率的選擇 將水芹粗黃酮樣液以0.5、1.0、1.5、2、2.5mL/min的速率通過AB-8樹脂層析柱，收集流出液，并測定流出液中總黃酮的含量，然后用水沖洗至流出液透明澄清，測定水洗液中總黃酮含量。計(jì)算不同流速下樹脂對黃酮的吸附率。

1.2.7 動(dòng)態(tài)吸附特征曲線 將濃度為（0.37±0.02）mg/mL的黃酮樣品液以1mL/min的流速通過裝有AB-8大孔樹脂的層析柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，分段收集流出液，每10mL為一份，共收集10份，并測定這10份流出液中黃酮含量，繪制動(dòng)態(tài)吸附曲線。

1.2.8 洗脫劑乙醇濃度的選擇 將水芹粗黃酮樣液以1mL/min的速率通過AB-8樹脂層析柱，收集流出液，并測定流出液中總黃酮的含量，然后用水沖洗至流出液透明澄清，測定水洗液中總黃酮含量。之后分別用8BV 60%、70%、80%、90%、100%乙醇以2mL/min速率洗脫。

1.2.9 洗脫劑體積對解吸效果的影響 確定洗脫劑體積的原則是，在充分洗脫下所吸附的物質(zhì)前提下，應(yīng)盡量節(jié)省洗脫劑用量。將黃酮含量為（30.70±0.47）mg水芹粗黃酮溶液以1mL/min的上樣速度經(jīng)AB-8樹脂進(jìn)行富集，飽和吸附30min，用蒸餾水洗脫，測定水洗部分黃酮含量。再取8BV 80%乙醇溶液洗脫，控制流速2mL/min，分段收集洗脫液，每1BV為1份，分別測定1、2、……、8BV洗脫液中黃酮含量。

1.2.10 洗脫速率的選擇 將水芹粗黃酮溶液以1mL/min流速上樣，充分吸附30min后，用水洗脫雜質(zhì)，再用80%乙醇以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/min洗脫，分別收集洗脫液并測定其中黃酮含量。

1.2.11 HPLC法分析純化前后水芹黃酮的成分及含量HPLC分析條件[15]：色譜柱Agilent SB-C18（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫：0～20min，15∶85→35∶65，20～30min，35∶65→45∶55，30～40min，15∶85；柱溫：40℃；流速1mL/min；檢測波長365nm；進(jìn)樣量10μL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別稱取0.01g標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁、槲皮素、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-3-L-鼠李糖苷、山奈酚混合并加色譜純甲醇溶解，于100mL容量瓶中定容。將標(biāo)準(zhǔn)溶液用色譜級甲醇稀釋成不同濃度梯度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取2mL左右的溶液經(jīng)微孔濾膜（0.22μm）過濾后置于進(jìn)樣瓶中進(jìn)行HPLC分析。

用HPLC測得的峰面積為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為X軸，計(jì)算得到5種黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線：蘆丁y=132190x+955.67，R2=0.998；槲皮素-3-O-葡萄糖苷y=293080x-17127，R2=0.999，槲皮素-3-L-鼠李糖苷y=174741x-8516.6，R2=0.998；槲皮素，y=112072+1295.2，R2=0.999山奈酚，y=248480x-122273，R2=0.998。

將水芹黃酮提取液濃縮并冷凍干燥后取（10.0±0.20）g溶解在10mL甲醇中進(jìn)行HPLC分析，取經(jīng)過最佳工藝純化后冷凍干燥的水芹黃酮提取物（10.0±0.35）g溶解在10mL甲醇中進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂的篩選

大孔吸附樹脂在分離物質(zhì)有效成分時(shí)，不僅要求樹脂吸附量大，而且還需要有較高的解吸率。因此，吸附率和解吸率測定是篩選樹脂的重要環(huán)節(jié)。由表2可知，弱極性樹脂AB-8對水芹黃酮吸附效果較其他樹脂要好，吸附率達(dá)到了71.37%，而非極性樹脂X-5對水芹黃酮吸附效果最差，表明水芹黃酮中非極性化合物相對較少。由表3可以看出，AB-8和NKA這兩種樹脂對黃酮解吸率較高，分別為76.57%和77.53%，NKA-9解吸效果較差。因?yàn)樗埸S酮是弱極性的，容易被弱極性樹脂吸附，同時(shí)AB-8樹脂比表面積較大，洗脫效果較好[16]。因此綜合吸附率和解吸率來看，選擇AB-8為實(shí)驗(yàn)所用大孔樹脂對水芹黃酮進(jìn)行純化。

大孔樹脂吸附過程涉及到熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的一些作用，理論上通常認(rèn)為大孔樹脂吸附過程需要經(jīng)歷液膜擴(kuò)散、顆粒內(nèi)擴(kuò)散、吸附反應(yīng)，一般情況下吸附反應(yīng)進(jìn)行比較快，對整個(gè)吸附過程影響不大，故液膜擴(kuò)散和顆粒內(nèi)擴(kuò)散成為主要控制吸附過程的因素。周英新[17]研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物結(jié)構(gòu)對靜態(tài)吸附存在明顯影響，并建立了基于黃酮類分子構(gòu)型的大孔樹脂吸附動(dòng)力學(xué)模型。另外，大孔樹脂吸附水溶液中的有機(jī)物是依靠范德華力、氫鍵、疏水作用，靜電作用。由此可以推測本實(shí)驗(yàn)中水芹黃酮的成分的結(jié)構(gòu)使得它在AB-8大孔樹脂中擴(kuò)散較快，親和力較強(qiáng)，故能夠達(dá)到較高吸附量。Zhenbin Chen等[18]研究證明，由于大孔樹脂中存在交錯(cuò)的孔結(jié)構(gòu)，吸附過程中發(fā)生的毛細(xì)管現(xiàn)象將顯著影響吸附特性。如果溶液滲透過大孔樹脂，發(fā)生毛細(xì)管液面上升，毛細(xì)現(xiàn)象被掩蓋。所以毛細(xì)現(xiàn)象是否發(fā)生取決于溶質(zhì)對大孔樹脂是否能夠浸潤，如果溶質(zhì)對大孔樹脂是浸潤液體，毛細(xì)液面下降會(huì)發(fā)生在溶液穿過大孔隙到小孔隙過渡時(shí)期的臨界點(diǎn)。但是，如果溶質(zhì)是不浸潤液體，吸附只發(fā)生在大孔表面甚至沒有吸附，毛細(xì)現(xiàn)象不會(huì)發(fā)生。因此可以推斷水芹黃酮溶液對大孔樹脂的浸潤程度也影響了吸附效果。

2.2 大孔樹脂純化水芹黃酮的工藝條件優(yōu)化

2.2.1 上樣流速的選擇 如表4所示，上樣流速對吸附率有一定的影響。上樣流速越大，流出液中黃酮含量越高，因?yàn)辄S酮溶液與樹脂接觸的時(shí)間短，不利于黃酮的吸附。理論上流速越慢對黃酮的吸附效果越好，但是為了提高效率縮短時(shí)間應(yīng)選擇合理的上樣速率，這里選擇1mL/min作為上樣速率，可使吸附率達(dá)到合適的范圍同時(shí)盡可能節(jié)約時(shí)間。

2.2.2 動(dòng)態(tài)吸附特征曲線 由圖1可看出，流份號為6的溶液黃酮濃度為0.039mg/mL，通常流出液的目標(biāo)物濃度達(dá)到上樣液目標(biāo)物濃度的1/10時(shí)，認(rèn)為達(dá)到了目標(biāo)物的泄漏點(diǎn)，AB-8樹脂動(dòng)態(tài)吸附水芹黃酮樣品液的泄漏點(diǎn)為60mL。

表2 六種大孔樹脂對水芹黃酮的吸附率Table 2 Comparison of adsorption quantity and rate of six types of macroporous resin on flavonoids in Oenanthe javanica

表3 六種大孔樹脂對水芹黃酮的解吸率Table 3 Comparison of desorption rate of six types of macroporous resin on flavonoids in Oenanthe javanica

表4 上樣流速對吸附率的影響Table 4 Effect of loaded rate on adsorption rate

表5 洗脫劑乙醇濃度對解吸率的影響Table 5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate

圖1 AB-8樹脂動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.1 Dynamic adsorption curve of AB-8 type macroporous resin

2.2.3 洗脫劑乙醇濃度的選擇 由表5可以看出，隨著乙醇濃度提高，解吸率同時(shí)提高，達(dá)到80%之后解吸率變化不太明顯，因此選擇80%乙醇為洗脫劑。

2.2.4 洗脫劑體積對解吸效果的影響 表6所示的洗脫劑用量和解吸率的關(guān)系表明洗脫劑用量達(dá)到4BV后解吸率達(dá)到71.86%±3.41%，之后隨洗脫液用量增加，解吸率提高幅度很小，基本保持不變?？紤]到綜合效益，選擇4BV為最佳洗脫體積。

表6 洗脫劑體積對洗脫效果的影響Table 6 Effects of the amount of eluent on elution results

2.2.5 洗脫速率的選擇 由表7可知隨著洗脫速度增加解吸率呈下降趨勢，洗脫流速在1～2mL/min之間變化幅度很小。因此，綜合洗脫率和生產(chǎn)效率來考慮可以選擇1.5mL/min作為洗脫速率。

2.3 樹脂的富集能力

按照以上工藝優(yōu)化得到的最佳條件，將黃酮含量為（42.60±0.80）mg的水芹粗黃酮溶液以1mL/min的速率上樣，用水洗至流出液透明澄清，然后用4BV 80%乙醇溶液以1.5mL/min洗脫，將洗脫液濃縮至無有機(jī)溶劑殘留，冷凍干燥后稱重為（55.57±0.78）mg，將其溶解后測得總黃酮含量為（29.88±0.59）mg產(chǎn)品純度為53.78%±1.79%。將黃酮含量同樣為（42.60±0.80）mg的水芹粗黃酮溶液烘干后稱重為（0.602±0.019）g，樣品純度為7.1%±0.10%。樹脂富集倍數(shù)為（53.78%±1.79%）/（7.1%±0.10%）=7.60±0.36。

2.4 水芹黃酮純化前后HPLC分析結(jié)果

五種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜見圖2。如圖3所示，純化前后黃酮種類沒有顯著變化，均為蘆丁、槲皮素、槲皮素-3-L-鼠李糖苷和山奈酚這四種黃酮，并且均未檢測出槲皮素-3-O-葡萄糖苷，而10min左右的峰未能有標(biāo)準(zhǔn)品對照，故未能檢測出來具體黃酮種類。將得到的峰面積對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各個(gè)黃酮種類的含量見表8，其中純化前黃酮含量占提取物總量的6.44%±0.28%，純化后黃酮含量占凍干樣品總量的55.65%±0.89%，總黃酮富集倍數(shù)為8.65±0.28，其中蘆丁富集倍數(shù)較高，為10.05±0.28。

圖2 五種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of five flavonoid standards

表7 洗脫速率對解吸率的影響Table 7 Effects of elution velocity on the desorption rate

表8 純化前后黃酮含量對比Table 8 Comparision of content of flavonoids before and after purified

圖3 經(jīng)AB-8大孔樹脂純化前后的水芹黃酮HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of flavonoids from Oenanthe javanica before and after purified by AB-8 type resin

3 結(jié)論

大孔樹脂在富集天然產(chǎn)物有效成分的應(yīng)用較為廣泛，影響其純化效果的因素很多，由于富集純化實(shí)驗(yàn)一般周期較長，誤差較大，通常只選擇其中較為重要的因素進(jìn)行考察[19]。通過實(shí)驗(yàn)考察了不同條件下AB-8樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解吸能力，確定了該樹脂的動(dòng)態(tài)吸附和解吸最佳條件為：以1mL/min的速度上樣后用水洗至流出液澄清透明，然后用4BV 80%乙醇以1.5mL/min的速度洗脫。經(jīng)過樹脂純化富集后，純度由7.1%提高到58.63%，富集倍數(shù)為7.6。

另外，對純化前后的水芹黃酮進(jìn)行HPLC法檢測分析其中成分的變化，發(fā)現(xiàn)水芹黃酮主要是黃酮醇類，包括蘆丁、槲皮素、槲皮素-3-L-鼠李糖苷、山奈酚。槲皮素是蘆丁和槲皮素-3-L-鼠李糖苷的苷元，蘆丁比槲皮素多一個(gè)二糖，槲皮素-3-L-鼠李糖苷比槲皮素多一個(gè)鼠李糖，山奈酚和槲皮素結(jié)構(gòu)相似，故選用蘆丁作為對照品，能比較準(zhǔn)確反映總黃酮含量。高效液相色譜法測得的以測得的黃酮含量總和為指標(biāo)計(jì)算得到純化前后總黃酮純度分別為6.44%和55.65%，樹脂對總黃酮的富集倍數(shù)為8.65，其中對蘆丁的富集倍數(shù)達(dá)到了10.05。在分析得到的HPLC圖譜中尚有未能確定的物質(zhì)峰，其具體成分和結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

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