朱志祥 梁炳生 馮勇 達(dá)志峰 丁潔 韋建 賈英偉

?論著?

RNAi技術(shù)體外沉默肌肉環(huán)指蛋白1的研究

朱志祥 梁炳生 馮勇 達(dá)志峰 丁潔 韋建 賈英偉

目的探討RNAi技術(shù)體外抑制大鼠肌肉環(huán)狀指蛋白1（MuRF-1）基因表達(dá)的效果，篩選出針對(duì)MuRF-1基因最有效的siRNA重組質(zhì)粒。方法根據(jù)大鼠MuRF-1基因的mRNA序列，設(shè)計(jì)4組干擾序列，即siRNA MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，利用lipofactamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠成肌細(xì)胞系L6，于轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot或免疫印跡檢測(cè)其對(duì)MuRF-1表達(dá)的抑制效果。MuRFl基因siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后mRNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)以x ± s表示。對(duì)照組與四組實(shí)驗(yàn)組的比較用單因素方差分析；多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。結(jié)果（ 1）實(shí)時(shí)定量PCR顯示四組干擾質(zhì)粒MuRF1-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對(duì)基因MuRF-1的mRNA的抑制率在轉(zhuǎn)染后48 h分別為67﹪、31﹪、11﹪，20﹪，不同干擾序列的抑制效果有差異（F = 4.527，P = 0.024）；72 h分別為79﹪、59﹪、50﹪和61﹪，不同干擾序列的抑制效果有差異（F = 19.088，P ＜ 0.001），與48 h相比，抑制效應(yīng)更為明顯，但以siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果最為明顯（t = 8.201,P ＜0.001）。（2）使用Western印跡灰度分析顯示四組干擾序列對(duì)基因MuRF-1的蛋白的抑制率在轉(zhuǎn)染后48 h分別為61﹪、40﹪、9﹪和15﹪，不同干擾序列的抑制效果有差異（F = 4.286，P = 0.028）；72 h分別為70﹪、54﹪、30﹪和46﹪，不同干擾序列的抑制效果有差異（F = 3.731，P = 0.042）；與48 h相比，MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效應(yīng)與對(duì)照組相比有顯著性差異（tⅠ= 3.256，P = 0.009；tⅡ= 2.512，P = 0.03），但MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ與對(duì)照組相比仍無顯著性差異（P ＞ 0.05）。四對(duì)序列中，以siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果最為明顯。蛋白水平的抑制效果與mRNA水平基本一致。結(jié)論 成功篩選出對(duì)MuRF-1基因有效的siRNA重組質(zhì)粒，即siRNA MuRF1-Ⅰ，為通過RNAi技術(shù)進(jìn)一步研究其功能以及基因靶向治療奠定了基礎(chǔ)。

成肌細(xì)胞； L6； MuRF-1； 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染； RNA干擾

肌肉環(huán)狀指蛋白1（muscle RING fi nger protein 1，MuRF-l）基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的骨骼肌特異表達(dá)的泛素蛋白連接酶，在多種原因所致的骨骼肌萎縮模型中mRNA水平表達(dá)明顯上調(diào)，被認(rèn)為是與骨骼肌蛋白降解有關(guān)的特異性基因，是多種肌萎縮的重要標(biāo)志[1-3]。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平，通過RNAi技術(shù)，采用lipofactamine 2000轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的質(zhì)粒于大鼠成肌細(xì)胞L6，用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot或免疫印跡方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染MuRF-1基因后mRNA及蛋白的變化，以期篩選出針對(duì)MuRF-1基因最有效的siRNA重組質(zhì)粒。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)試劑與主要儀器

大鼠骨骼肌成肌細(xì)胞系L6（美國(guó)ATCC公司），質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR（上海銳賽生物技術(shù)有限公司），胎牛血清為（美國(guó)Gibco公司），DMEM（高糖）細(xì)胞培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司），胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），Genelute Plasmid MiniPrep Kit（美國(guó)Sigma公司），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. MuRF-1基因的siRNA重組質(zhì)粒的制備：查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲取目的基因miRNA干擾序列，針對(duì)大鼠MuRF-1基因序列設(shè)計(jì)并合成4個(gè)miRNA干擾序列，經(jīng)合成、載體構(gòu)建、酶切鑒定、測(cè)序正確及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選出有效干擾序列（siRNA重組質(zhì)粒：由上海銳賽生物技術(shù)有限公司構(gòu)建并鑒定siRNA重組質(zhì)粒）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：L6細(xì)胞系用含10﹪胎牛血清的DMEM-HG，置于5﹪CO2、37℃條件下培養(yǎng)、傳代。

3.實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)設(shè)立MuRFl基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組2組，每組設(shè)48 h和72 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，為保證實(shí)驗(yàn)的均衡性，同一時(shí)期的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分布在同一培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：（1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)效率的檢測(cè)（熒光顯微鏡檢測(cè)）：報(bào)告基因質(zhì)粒pEGFP-N1與重組質(zhì)粒按等比例共轉(zhuǎn)染，48 h后于498 nm激發(fā)波長(zhǎng)的熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達(dá)變化，優(yōu)化與檢測(cè)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率；（2）MuRFl基因siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：6孔培養(yǎng)板中細(xì)胞密度接近（0.5 ～ 2）×105/ml（此時(shí)匯合率約為50﹪～ 60﹪）；37℃、5﹪CO2正常孵育細(xì)胞過夜，siRNA重組質(zhì)粒DNA加入Opti-MEM培養(yǎng)液中，輕柔混勻，輕柔混勻Lipofectamine 2000，取5 μl稀釋于Opti-MEM培養(yǎng)液中，輕柔混勻，室溫孵育5 min，將質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育20 min以便形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃、5﹪CO2孵育細(xì)胞48 ～ 72 h，其中轉(zhuǎn)染24 h后可以給細(xì)胞更換培養(yǎng)液，于轉(zhuǎn)染后48h與72 h檢測(cè)。

5.檢測(cè)指標(biāo)：（1）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染MuRFl基因后mRNA的表達(dá)變化：用超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取組織樣本中總RNA（實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行）；取5 μl RNA用1﹪瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio. Co.Ltd，Cat#CW0744）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增（冰上操作），PCR軟件分析擴(kuò)增曲線和溶解度曲線并記錄達(dá)到熒光閾值時(shí)的循環(huán)次數(shù)（cycle threshold，Ct值），采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析；（2）使用Western印跡灰度分析轉(zhuǎn)染MuRFl基因后蛋白的表達(dá)變化：經(jīng)過蛋白提取、蛋白定量、蛋白質(zhì)電泳、蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移、染色、封閉及與抗體（一抗：兔抗大鼠MuRF-1多克隆抗體1:100，二抗：山羊抗兔IgG1:4000，內(nèi)參照：GAPDH）結(jié)合后用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，之后用SBIO-RAD圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析，以各因子灰度與內(nèi)參照灰度之比代表組織內(nèi)MuRF-1蛋白的含量，以各灰度比與對(duì)照組灰度比的比值作為各蛋白因子的表達(dá)強(qiáng)度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MuRFl基因siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后mRNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)以± s表示。對(duì)照組與四組實(shí)驗(yàn)組的比較用單因素方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

培 養(yǎng) 的 大 鼠 成 肌 細(xì) 胞 系L6（圖1），pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR與siRNA重組質(zhì)粒按1:1共轉(zhuǎn)染后48 h，熒光顯微鏡于498 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察可見細(xì)胞中有大量明亮的綠色熒光，表明了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)有著較高的轉(zhuǎn)染效率（圖2）。

圖1 倒置顯微鏡下觀察大鼠成肌細(xì)胞 L6 生長(zhǎng)情況(10 × 40)

圖2 熒光顯微鏡下(498 nm)觀察轉(zhuǎn)染后大鼠成肌細(xì)胞L6

二、MuRFl基因siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)變化

轉(zhuǎn)染后48 h和72 h實(shí)時(shí)定量PCR分析結(jié)果（表1），干擾序列MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ、MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ對(duì)MuRFl基因mRNA的48 h抑制率分別為67﹪、31﹪、11﹪和20﹪，與對(duì)照組相比MuRFl-Ⅰ組有顯著性差異（t = 3.922，P = 0.003）；其他三組序列間抑制效應(yīng)與對(duì)照組無明顯差異（P ＞ 0.05)；轉(zhuǎn)染后72 h抑制率分別為79﹪、59﹪、50﹪和61﹪，不同干擾序列的抑制效果有差異（F = 19.088，P ＜ 0.001）；與48 h相比，抑制效應(yīng)更為明顯；以MuRFl-Ⅰ的抑制效果最為明顯。

表1 MuRFl基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h、72h實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果（n = 3）

三、MuRFl基因siRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)變化

轉(zhuǎn)染后48 h和72 h，Western印跡灰度分析結(jié)果（表2），各干擾序列MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ、MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ對(duì)MuRFl蛋白的48 h抑制率分別為61﹪、40﹪、9﹪和15﹪，MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ與對(duì)照組相比有顯著性差異（tⅠ= 3.588，P = 0.005；tⅡ= 2.353,P = 0.04）；轉(zhuǎn)染后72 h，顯示各干擾序列MuRFl-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ對(duì)MuRFl蛋白的抑制率分別為70﹪、54﹪、30﹪、46﹪與48 h相比，MuRFl-Ⅰ、MuRFl-Ⅱ抑制效應(yīng)更為明顯，但MuRFl-Ⅲ和MuRFl-Ⅳ與對(duì)照組相比仍無顯著性差異（P ＞ 0.05）。4對(duì)序列中，以siRNA MuRFl-Ⅰ的抑制效果最為明顯，蛋白水平的抑制效果與mRNA水平基本一致。

表2 MuRFl基因siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h、72 h后Western印跡結(jié)果（n = 3）

討 論

骨骼肌在失神經(jīng)支配早期會(huì)出現(xiàn)快速萎縮，這一事實(shí)表明骨骼肌中蛋白代謝的動(dòng)態(tài)平衡被打破了，蛋白降解占據(jù)了明顯優(yōu)勢(shì)，而泛素-蛋白酶體蛋白水解途徑中相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)、活性增強(qiáng)在此過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[3-4]，泛素連接酶E3可以分為：含HECT結(jié)構(gòu)域（homologous to E6-AP C terminus）、RING結(jié)構(gòu)域（ring fi nger domain）以及其他組分，是骨骼肌內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑，泛素蛋白酶體系中的關(guān)鍵酶，其決定了整個(gè)系統(tǒng)降解蛋白的特異性[5]。近來的研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，在禁食、失神經(jīng)支配、癌癥、腎功能衰竭，糖皮質(zhì)激素或細(xì)胞因子治療等形成的肌肉萎縮模型中，肌肉萎縮盒F基因（muscle atrophy F-box，MAFbx）和MuRFl基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著升高。MAFbx編碼的蛋白含有F-box結(jié)構(gòu)域，此為E3泛素蛋白連接酶家族中SCF復(fù)合物（Skpl-Cull-Fbox）中的特征性結(jié)構(gòu)。MuRF-l已被證實(shí)具有泛素蛋白連接酶活性，而此活性依賴于RING結(jié)構(gòu)域的存在[7-8]。

Bodine等[9]通過評(píng)價(jià)肌肉濕質(zhì)量的維持率，證明敲除MuRF-l基因的小鼠可以抵抗肌萎縮，在失神經(jīng)后14 d，與對(duì)照組相比可以使失神經(jīng)腓腸肌濕重少損失36﹪。近來的研究表明[10-11]，細(xì)胞活素類腫瘤壞死因子-a、蛋白水解誘導(dǎo)因子和血管緊張素Ⅱ等可通過活性氧簇的增加誘導(dǎo)核因子-κB的激活，導(dǎo)致蛋白酶體亞單位和泛素連接酶MuRF-l基因表達(dá)增加，肌蛋白降解。吳啟平等[12]研究認(rèn)為，MuRF-1可降解骨骼肌中的粗肌絲成分，使骨骼肌的蛋白松散而更易被降解，而細(xì)肌絲成分卻可以得到較大程度的保存。結(jié)合上述國(guó)內(nèi)外研究足以說明，MuRF-1在失神經(jīng)骨骼肌萎縮中發(fā)揮著重要的作用，為從分子水平調(diào)控失神經(jīng)后骨骼肌蛋白的高分解代謝，防止肌肉萎縮的發(fā)生提供了依據(jù)。

RNA干擾是近年發(fā)展起來的一種阻抑基因表達(dá)的新技術(shù)，它通過導(dǎo)入一段與內(nèi)源性靶基因同源的雙鏈RNA序列，在轉(zhuǎn)錄水平關(guān)閉相應(yīng)靶基因mRNA，使其相應(yīng)蛋白表達(dá)缺失或下調(diào)的過程，是一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已成為開展疾病基因治療的新的方向。

在前期研究中[13-16]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)在失神經(jīng)后骨骼肌細(xì)胞中MuRF-1基因和蛋白在早期的高表達(dá)與失神經(jīng)骨骼肌萎縮的發(fā)生密切相關(guān)，控制它們的表達(dá)可有效地延緩骨骼肌萎縮。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過RNAi干擾技術(shù)，篩選出對(duì)MuRF-1基因有效的siRNA重組質(zhì)粒，為通過RNAi技術(shù)進(jìn)一步研究其功能以及基因靶向治療奠定了基礎(chǔ)。針對(duì)目的基因不同位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的siRNA序列在誘導(dǎo)RNAi的作用效力方面存在顯著的差異，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4組干擾序列，以篩選出最優(yōu)的干擾序列。siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，其抑制效應(yīng)會(huì)在轉(zhuǎn)染后幾小時(shí)到幾天出現(xiàn)，但部分研究顯示出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后48 ～ 72 h，因此本實(shí)驗(yàn)選用了48 h及72 h進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)MuRF-1構(gòu)建的4個(gè)siRNA重組質(zhì)粒，經(jīng)mRNA和蛋白水平的檢測(cè)證實(shí)siRNA MuRF1-Ⅰ的抑制效果明顯高于其他三組（P ＜ 0.05），且72 h抑制效果更明顯。蛋白水平的變化幅度較轉(zhuǎn)錄水平低的原因可能為：（1）兩種檢測(cè)方法的敏感性不同有關(guān)，即westemblot遠(yuǎn)沒有實(shí)時(shí)定量PCR敏感；（2）蛋白質(zhì)的半衰期要遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于mRNA[13]。

本研究中成功篩選出對(duì)MuRF-1基因有效的siRNA重組質(zhì)粒，siRNA MuRF1-Ⅰ，為通過RNAi技術(shù)進(jìn)一步研究其功能以及基因靶向治療奠定了基礎(chǔ)，從轉(zhuǎn)錄水平抑制某些特異性表達(dá)上調(diào)的基因或采用相關(guān)的蛋白酶體抑制劑，有望成為延緩肌肉萎縮新的、有效的途徑。

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Silencing muscle RING finger protein 1 by RNAi in vitro

ZHU Zhi-xiang, LIANG Bing-sheng, FENG Yong, DA Zhi-feng, DING Jie, WEI Jian, JIA Ying-wei. Department of Orthopaedics (Micro and Hand Surgery), The 2nd Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

LIANG Bing-sheng, Email:liangbs707@yahoo.com

Objective To investigate the efficiency of RNAi technique in inhibiting MuRF-1 gene expression in rat muscle.MethodsFour siRNA recombinant plasmids were designed according to the rat MuRF-1 gene mRNA sequence (siRNA MuRF1-Ⅰ ,Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ) . Lipofactamine 2000 transfection reagent was used to transfect the plasmids into rat myoblasts L6 and MuRF-1 expression was evaluated after 48 h and 72 h respectively, using real-time quantitative PCR, Western blot amd immunoblot.Results(1) Real-time quantitative PCR showed plasmids MuRF1-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ, and Ⅳ inhibited MuRF-1 mRNA by 67﹪, 31﹪, 11﹪, and 20﹪ respectively after 48 h, the inhibitory effects of the four plasimds were significant different(F = 4.527, P = 0.024); At 72 h, the inhibition rates were 79﹪, 59﹪, 50﹪and 61﹪ for the 4 plasimds and difference was significant among the 4 plasimds (F = 19.088, P ＜ 0.001)Compared with 48h, the inhibitory effect was greater at 72 h, especially for siRNA MuRF1-Ⅰ (t = 8.201, P ＜ 0.001 ). (2)Western blot analysis revealed the protein inhibition rates after transfection for 48h were 61﹪, 40﹪, 9﹪ and 15﹪ respectively The inhibitory effect of different plasmids was significantly different (F = 4.286, P = 0.028). At 72h, the inhibition rates were 70﹪ , 54﹪, 30﹪, and 46﹪, respectively (F = 3.731, P = 0.042). At 72 h, the inhibition was greater for MuRFl -Ⅰand MuRFl -Ⅱcompared to 48 h (tⅠ= 3.256, P = 0.009;tⅡ= 2.512, P = 0.03). MuRFl-Ⅲ and MuRFl-Ⅳ did not inhibit the gene expression as compared with the control group ( P ＞ 0.05 ). Among the four plasmids, the inhibitory effect of siRNA MuRF1-Ⅰ was greatest. The inhibitory effect on mRNA and protein levels were similar.Conclusion siRNA MuRF1-Ⅰ may be used for further study of gene function and gene therapy.

Muscle cell； L6； MuRF-1； Plasmid transfection； RNA interference

2013-01-19)

(本文編輯：蔡曉珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.005

國(guó)家自然科學(xué)青年基金（81000805）

030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科（朱志祥、梁炳生、馮勇、達(dá)志峰、丁潔、韋建、賈英偉）；上海市第六人民醫(yī)院骨科（馮勇）

梁炳生，Email：liangbs707@yahoo.com

朱志祥，梁炳生，馮勇，等.RNAi技術(shù)體外沉默肌肉環(huán)指蛋白1的研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版, 2013,