曲乃方 王者令 閆兆平 袁友斌 張軼停

?論著?

38例慢性肝衰竭患者經(jīng)干細胞治療48周效果觀察

曲乃方 王者令 閆兆平 袁友斌 張軼停

目的 通過外周血單個核細胞與臍帶間充質(zhì)干細胞治療對慢性肝衰竭患者超過48周療效以探索干細胞治療肝衰竭的應(yīng)用前景。方法選取2006年11月至2011年12月期間在青島市傳染病醫(yī)院住院的78例慢性肝衰竭患者，其中38例慢性肝衰竭患者為移植組，31例進行自體外周血單個核細胞移植、7例進行臍帶間充質(zhì)干細胞移植，通過肝動脈介入將干細胞注入患者肝臟，觀察移植48周后患者臨床癥狀改善情況及肝臟功能恢復(fù)情況。40例慢性肝衰竭患者常規(guī)治療作為對照組。采用t檢驗與c2檢驗，比較移植組與對照組間各臨床療效指標的差異性。結(jié)果干細胞移植后腹水消失或減少者34例（89.4﹪），食欲改善者36例（94.7﹪），體力好轉(zhuǎn)者36例（94.7﹪），腹脹消失者29例（76.3﹪），與對照組比較無顯著差異；PTA水平由平均26.1﹪升至54.9﹪（t = 123.5，P = 0.003），白蛋白逐漸升高，由平均25.3 μmol/L升至34.5 μmol/L（t = 20.8，P ＜ 0.05)。移植組child評分由13.2 ± 2.4降至7.0 ± 2.1(P ＜ 0.001)，對照組child評分無顯著變化。與對照組相比干細胞移植后患者肝功能明顯改善。38例移植患者中未發(fā)現(xiàn)嚴重并發(fā)癥。結(jié)論通過對外周血單個核細胞與臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療后患者48周觀察，證明干細胞移植對慢性肝衰竭患者治療后肝功能明顯改善，死亡率降低，提高生活質(zhì)量。

干細胞； 移植； 肝衰竭

目前，由肝炎病毒、酒精和藥物、部分遺傳代謝等因素導(dǎo)致的肝臟功能嚴重障礙或衰竭的治療，仍然是困擾臨床醫(yī)生的難題。即使給予非常系統(tǒng)的內(nèi)科治療，其病死率亦高達70﹪以上。肝移植是目前唯一有效的方法，但是肝源的稀缺和移植后的排異反應(yīng)使得能通過肝移植來治療肝衰竭的患者鳳毛麟角。近年來，干細胞移植在肝硬化方面的研究為本研究提供了一條新的思路。本研究自2006年11月始開展了外周血單個核細胞移植治療項目、2011年開展了間充質(zhì)干細胞移植工作，取得了良好的治療效果。

資料與方法

一、病例選擇

選取2006年11月至2011年12月期間在我院住院治療的78例慢性肝衰竭患者，所有患者都知情同意。38例慢性肝衰竭患者年齡36 ～ 58歲，其中丙型病毒性肝炎、酒精性肝硬化各1例；診斷符合2000年病毒性肝炎防治方案診斷標準[1]及2005年5月中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會肝衰竭與人工肝學(xué)組肝衰竭診治指南。根據(jù)患者經(jīng)濟條件及年齡，31例患者行自體骨髓干細胞移植治療，7例行間充質(zhì)干細胞移植治療，兩者作為治療組，即在對照組治療基礎(chǔ)上行干細胞移植治療。對照組40例（相同時間對應(yīng)抽取），年齡35 ～ 59歲，給予綜合治療，包括保肝、抗炎、對癥、血制品、人工肝支持療法等。

主要試劑及儀器：血細胞分離機（美國血液技術(shù)公司）、血細胞分析儀（美國Heraeus公司）；生化分析儀（美國貝克曼公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、數(shù)字胃腸機（東軟公司）、流式細胞儀（FACSCalibur，美國BD公司）。人臍帶間充質(zhì)干細胞來自于國家干細胞與生物診療工程研究中心。

二、方法

1.骨髓動員：患者術(shù)前3或4 d開始皮下注射粒細胞集落刺激因子（惠爾血），每日200 μg。

2.外周血干細胞的分離、采集：骨髓干細胞動員達到標準后（外周血淋巴細胞與單核細胞之和1×109/L水平以上），應(yīng)用血細胞分離機（HaemoneticsR）進行分離并采集，細胞數(shù)量在1.0 × 106～ 1.0 × 107/L。

3.干細胞移植：患者在局部麻醉下，行肝動脈介入，在X線引導(dǎo)下，將干細胞通過導(dǎo)管從肝動脈緩慢給入病變部位。之后用10 ml等滲鹽水沖洗管腔。劑量：每次骨髓干細胞移植數(shù)量（總個數(shù)）1.0 × 106以上；臍帶干細胞（總個數(shù)）在1.5 × 107以上，每位患者移植1次。

4.觀察指標：主要觀察項目是：（1）病死率；（2）臨床表現(xiàn)，包括腹水，食欲、體力、腹脹、睡眠等癥狀改善情況，及術(shù)后的不良反應(yīng)情況；（3）肝功能檢測結(jié)果，包括檢測白蛋白（Alb），凝血酶原活動度（PTA），肝功能評分（Child-Pugh分級）等指標。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，SUVmax數(shù)據(jù)以x ± s表示，其中白蛋白比較、凝血酶元活動度比較、肝功能評分采用t檢驗，移植前后臨床表現(xiàn)恢復(fù)情況、生存率比較采用c2檢驗。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

移植組2周開始，臨床癥狀明顯改善，PTA及白蛋白水平逐漸升高，與對照組相比有明顯差異，表明移植組患者肝功能表現(xiàn)出明顯的治療效果。在38例移植患者中未發(fā)現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，但大部分自體骨髓干細胞移植患者在動員過程中出現(xiàn)短暫發(fā)熱、骨痛癥狀，間充質(zhì)干細胞移植患者無任何不良反應(yīng)?；颊?周后病情逐漸穩(wěn)定但仍在持續(xù)恢復(fù)中，本研究把觀察48周后相關(guān)數(shù)據(jù)分別如下：

1.兩組經(jīng)治療48周后臨床表現(xiàn)恢復(fù)情況：患者肝功能在移植48周后，隨肝功能明顯改善，患者臨床表現(xiàn)逐步改善，經(jīng)比較，體力好轉(zhuǎn)、食欲好轉(zhuǎn)、腹水減少方面兩組差別不顯著，而腹脹消失方面兩組差別有統(tǒng)計學(xué)意義（c2= 13.447，P ＜0.01，表1）。

2.兩組經(jīng)治療48周后白蛋白（Alb，g/L）恢復(fù)情況：經(jīng)比較，移植組治療后療效顯著，而對照組治療前后無明顯差別，兩組治療后比較（t = 14.441，P = 0.000），差別有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

3.兩組經(jīng)治療48周后凝血功能恢復(fù)情況：移植組在干細胞移植后凝血酶原活動度（PTA）逐漸上升，與對照組比較，t = 31.447，P = 0.000，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，患者凝血機制明顯改善，移植組明顯優(yōu)于對照組（表3）。

4.肝功能評分（Child-Pugh分級）按照Child-Pugh分級標準，移植組48周后肝功能已由失代償狀態(tài)進入可代償狀態(tài)，而對照組變化不大，仍以失代償為主（表4）。

5.干細胞移植對患者短期生存率的影響：移植組患者在移植后48周死亡2人，其中1例在1周死于惡性潰瘍病穿孔，1例病情過重死亡，生存率為94.8﹪。對照患者48周統(tǒng)計死亡11人，生存率72.5﹪，c2= 6.938，P = 0.008，差別有統(tǒng)計學(xué)意義，移植組明顯優(yōu)于對照組。

表1 兩組經(jīng)治療48周后臨床表現(xiàn)恢復(fù)情況[例數(shù)（﹪）]

表2 兩組經(jīng)治療48周后白蛋白（g/L± s）恢復(fù)情況

表2 兩組經(jīng)治療48周后白蛋白（g/L± s）恢復(fù)情況

組別 例數(shù) 治療前 治療后 d P值移植組 38 25.3 ± 1.7 34.5 ± 1.6 8.57 0.000對照組 40 26.2 ± 2.1 27.3 ± 2.7 1.01 0.620 t值 2.074 14.441 P值 0.042 0.000

表3 兩組經(jīng)治療48周后凝血酶原活動度（﹪，± s）變化情況

表3 兩組經(jīng)治療48周后凝血酶原活動度（﹪，± s）變化情況

組別 例數(shù) 治療前 治療后 d P值移植組 38 26.1 ± 3.2 54.9 ± 4.1 28.3 0.003對照組 40 26.8 ± 4.2 30.3 ± 2.7 3.6 0.781 t值 0.825 31.447 P值 0.412 0.000

表4 兩組經(jīng)治療48周后肝功能評分（分，± s）變化情況

表4 兩組經(jīng)治療48周后肝功能評分（分，± s）變化情況

組別 例數(shù) 移植前 移植后 P值移植組 38 13.2 ± 2.4 7.0 ± 2.1 0.000對照組 40 13.3 ± 2.1 12.1 ± 2.4 0.078 t值 0.196 9.967 P值 0.845 0.000

6.干細胞移植后不良反應(yīng)的發(fā)生情況：在移植患者中未發(fā)現(xiàn)嚴重并發(fā)癥，但自體骨髓干細胞移植治療因動員過程中需應(yīng)用集落刺激因子，大部分患者出現(xiàn)短暫發(fā)熱、骨痛癥狀，經(jīng)簡單對癥恢復(fù)。

7.關(guān)于自體骨髓干細胞移植與間充質(zhì)干細胞移植：目前后者例數(shù)尚少，但除1例死亡外（病情過重），其他與整體統(tǒng)計情況一致。

討 論

干細胞是一類具有自我復(fù)制和分化能力的細胞。大量研究表明[1-2]，骨髓干細胞能夠分化為肝細胞，參與細胞再生，參與肝功能的修復(fù)和重構(gòu)[3-4]。Theise等[5]報道，骨髓細胞在體內(nèi)不但能分化為肝細胞，而且能分化為膽管細胞。國內(nèi)外已有多項臨床實驗應(yīng)用外周血干細胞[6-7]治療失代償期肝硬化并取得良好療效。，而經(jīng)動員后獲得的單個核細胞主要為骨髓中含多種組份的外周血干細胞。

間充質(zhì)干細胞是干細胞家族的重要成員，因具有多向分化潛能、造血支持、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。研究表明間充質(zhì)干細胞具有強大的旁分泌作用，其在微環(huán)境中分泌一系列的細胞因子和信號分子[8]，減輕免疫炎癥反應(yīng)，抑制凋亡，抑制肝酶釋放，促進肝細胞再生，從而促進肝組織重建、肝功能恢復(fù)[9]。國外學(xué)者在應(yīng)用間充質(zhì)干細胞治療失代償期肝硬化的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗中取得良好療效，并且未發(fā)生不良反應(yīng)和嚴重并發(fā)癥[10-11]。

本研究采用的供體干細胞是骨髓干細胞及間充質(zhì)干細胞。前者受年齡限制，年齡過大則影響其數(shù)量及質(zhì)量，后者不受年齡限制且制作技術(shù)較成熟，但在功效上卻異曲同工。本研究觀察的病例中，移植后無排斥反應(yīng)，不必考慮組織相容性抗原的配型問題，具有良好應(yīng)用前景。且于移植2周始全身及局部表現(xiàn)、肝臟功能逐漸恢復(fù)，3個月以后逐漸趨于穩(wěn)定并進入良性循環(huán)，48周結(jié)果更趨滿意，部分病例在超聲形態(tài)學(xué)描述中已由原來的典型肝硬化表現(xiàn)變?yōu)樵缙诟斡不踔谅伪憩F(xiàn)。當(dāng)然，干細胞在肝臟內(nèi)的修復(fù)機制還需進一步研究。

本研究初步探討了干細胞移植對肝衰竭的治療作用，不存在免疫排斥反應(yīng)，價格低廉，療效滿意，有利于推廣應(yīng)用，具有良好前景。研究將為肝病治療打開嶄新途徑，結(jié)果令人鼓舞，為干細胞的進一步治療研究打下基礎(chǔ)。

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Stem cell transplantation for chronic liver failure: a report of 38 cases over 48 weeks

QU Nai-fang, WANG zhe-ling, YAN Zhao-ping, YUAN You-bin. Department of Hapatopathy,Qingdao Infectious Disease Hospital, Qingdao 266000, China

QU Nai-fang, Email:naifang@163.com

Objective To evaluate the efficacy and safety of autologous peripheral blood mononuclear cell and mesenchymal stem cell transplantation for chronic liver failure patients over 48 weeks.MethodsIn 38 patients of chronic hepatic failure, 31 patients were treated by autologous peripheral blood mononuclear cell transplantation, the other 7 patients were treated by mesenchymal stem cell transplantation in addition to standard treatments. 40 patients with chronic hepatic failure as control group and received standard treatments. We transplanted the peripheral blood mononuclear cell and mesenchymal stem cell into hepatic artery through a femoral artery catheter. Liver function of patients was evaluated after 48 weeks after transplantation. Improvements of clinical symptoms and liver function were caompared.ResultsMost patients’ clinical performance improved significantly after transplantation, Ascites disappeared or decreased in 34 cases (89.4﹪); Appetite improved in 36 cases (94.7﹪); Physical strength improved in 36 cases (94.7﹪ ); Abdominal distension disappeared in 29 cases (76.3﹪ ). The average PTA level increased from 26.1﹪ to 54.9﹪ ; Albumin level gradually increased, which rose from 25.3 μmol/L to 34.5 μmol/L in average. Compared withthe control group, the liver function improved significantly in transplanting group. No serious complications occurred during and after transplantation in all patients. But most patients showed transient fever and bone pain in the mobilization process.ConclusionsThrough a long-term observation, we found that the transplantation of autologous peripheral blood mononuclear cell and umbilical cord mesenchymal stem cell waw safe and effective for patients of hepatic failure. After transplantation, the liver function was improved notablely, the clinical symptoms were alleviated, the mortality decreased and the quality of life was improved.

Stem cell； Transplantation； Hepatic failure

2012-06-19)

(本文編輯：陳媛媛)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.004

266000，青島市傳染病醫(yī)院肝病一區(qū)

曲乃方，Email：naifang@163.com

曲乃方，王者令，閆兆平，等.38例慢性肝衰竭患者經(jīng)干細胞治療48周效果觀察[J/CD].中華細胞與干細胞雜志：電子版, 2013, 3(2):73-77.