姜國成 明 健 姜彥多

?論著?

PRL-3促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞侵襲能力

姜國成 明 健 姜彥多

目的 探討肝再生磷酸酶（PRL-3）在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的關(guān)系。方法應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和Western方法檢測了PRL-3在2種子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并在兩種細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA 24、36、48、60和72 h后檢測PRL-3的表達(dá)情況。同時應(yīng)用transwell小室觀察抑制PRL-3后，兩種細(xì)胞侵襲能力的變化。采用獨(dú)立t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對照組間PRL-3的結(jié)果的差異。結(jié)果PRL-3在2種子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系中均高表達(dá)。在兩種細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA 36 h后，PRL-3表達(dá)最低（P ＜ 0.01），并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞遷移[細(xì)胞數(shù)為(18.67 ± 7.49)個、(15.96 ± 8.42)個，與各對照組比較，t值分別為5.23 ～ 6.45、3.32 ～ 5.33間，P均= 0.000]；轉(zhuǎn)染后HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞侵襲[細(xì)胞數(shù)為（4.67 ± 0.98）個、（3.89 ± 1.09）個，與各對照組比較，t值分別為4.86 ～ 6.98、4.36 ～ 5.64間，P均= 0.000]。結(jié)論P(yáng)RL-3在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且下調(diào)PRL-3能夠抑制細(xì)胞遷移和侵襲能力。

PRL-3； 子宮內(nèi)膜腫瘤； 腺癌； 腫瘤侵潤

【Key words】Phosphatase of regenerating liver-3； Endometrial neoplasms； Adeno carcinoma； Neoplasm invasiveness

“肝再生磷酸酶3（phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3）是一種蛋白酪氨酸磷酸酶，通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分子酪氨酸殘基的磷酸化，調(diào)控蛋白質(zhì)活性，它參與多種細(xì)胞生命活動。Saha等[1]篩選結(jié)直腸原發(fā)癌與肝轉(zhuǎn)移灶的差異表達(dá)基因時發(fā)現(xiàn)，正常結(jié)直腸組織、良性腺瘤和結(jié)直腸癌原發(fā)灶中，PRL-3基本不表達(dá)或低表達(dá)，而在肝轉(zhuǎn)移灶中均高表達(dá)，因此推測，該基因與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。隨后許多學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)PRL-3在乳腺癌、卵巢癌、腸癌、肺癌和胃癌等腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)并與其轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2-7]。但在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中PRL-3表達(dá)如何，其表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞遷徙和轉(zhuǎn)移是否存在相關(guān)性尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR） 和 Western blot方法檢測了2種子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中PRL-3的表達(dá)情況，并對PRL-3影響子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞遷移和侵襲進(jìn)行了初步的研究。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

凍存于液氮的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后，子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞用MEM（minimum essential medium，MEM，Gibco，USA）培養(yǎng)液（含有10﹪新生牛血清，100 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素），在37℃、5﹪CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。

二、RT-PCR

提取細(xì)胞總RNA，按RT-PCR（TaKaRa）試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為 20 μl，取 4 μl的 RT產(chǎn) 物 進(jìn) 行 PCR反應(yīng)，反 應(yīng) 體 系 為 20 μl。PCR引 物 經(jīng) 在GeneBank上比對后在 bio-spring公司合成。F：5'-GGGACTTCTCAGGTCGTGTC-3'，R：5'-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3'片段長度 245 bp。β-actin F：5'-AAATCGTGCGTGACA TTAA-3'，R:5'-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3'，片段長度：513 bp。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

三、Western Blot法

在收集的細(xì)胞內(nèi)加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4℃，12000 r/min，30 min），提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60 μg。電泳（12﹪SDS-PAGE凝膠）、轉(zhuǎn)?。?0V，120 min）、5﹪正常小牛血清封閉，一抗PRL-3（1:100）和β-actin（1:200）（美國Santa Cruz公司），4℃孵育過夜，分別與各自對應(yīng)的二抗（1:2500，美國chemicon公司）室溫孵育2 h，DAB顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀（Chemi Imager 5500，美國Alpha Innotech公司）采集，進(jìn)行灰度值測定。

四、RNA干擾

用LipofetamineTM 2000（美國Invitrogen公司）將20 μmol/L PRL-3 siRNA（美國Santa Cruz公司）轉(zhuǎn)染入6孔板中HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞中為RNA提取和transwell備用。實(shí)驗(yàn)分4組：Untreated為未加任何處理因素的細(xì)胞（對照1組），Empty為只轉(zhuǎn)染LipofetamineTM 2000的細(xì)胞（對照2組），scramble為轉(zhuǎn)染亂碼序列的細(xì)胞（對照3組），sense為轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA的細(xì)胞（PRL-3組）。其中對照組細(xì)胞為（untreated、empty和scramble）。每個實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，轉(zhuǎn)染具體步驟按LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）試劑說明書進(jìn)行。

五、細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測

在transwell小室(美國Corning公司)下室加入600 μl含10﹪小牛血清培養(yǎng)基，上室中加入100 μl無血清培養(yǎng)基，接種細(xì)胞數(shù)為2.5 × 104個。37℃、5﹪CO2孵箱中培養(yǎng)6 h后吸凈培養(yǎng)基，PBS清洗后，甲醇室溫固定15 min，用棉簽輕擦掉微孔膜上表面的細(xì)胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜。取下微孔膜，置載玻片上，鏡下觀察。細(xì)胞侵襲能力的測定用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基以1:7稀釋Matrigel（美國BD Biosciences公司）加入上室100 μl，在室溫下放置6 h。使用前用培養(yǎng)基重新水化并吸凈，其他與遷移實(shí)驗(yàn)相同，培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，WesternBlot和RT-PCR表達(dá)結(jié)果及遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)采用s表示，各實(shí)驗(yàn)組與對照組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PRL-3在2種子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

為了明確子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中PRL-3的表達(dá)情況，本研究用RT-PCR和Western相對定量的方法檢測了2種子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞中PRL-3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，2種子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞細(xì)胞中PRL-3均高表達(dá)（圖1）。

二、在HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA的時效性

為了確定PRL-3 siRNA在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中沉默PRL-3表達(dá)的最佳效率，在PRL-3 siRNA 0、24、36、48、60、72 h后，用RT-PCR相對定量的方法檢測了PRL-3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染36 h時，PRL-3表達(dá)最低（P ＜ 0.01，圖2）。

三、阻斷PRL-3能抑制HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞遷移和侵襲能力

圖1 PRL3在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA PRL-3的時效

為了進(jìn)一步了解PRL-3在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中的作用，在HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA 36 h后，用transwell小室的方法觀察HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。

表1 PRL-3對子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞遷移能力的影響(個,x± s)

表2 PRL-3對子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響(個,x± s)

細(xì)胞遷移能力測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA的HEC-1-B細(xì)胞穿透數(shù)目，與對照組untreated、empty和scramble相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，圖3a）；轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA的AN3 CA細(xì)胞穿透數(shù)目，與3個對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.001,表1，圖3b）。

基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA的HEC-1-B細(xì)胞穿透數(shù)目，與3個對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2，圖3c）；轉(zhuǎn)染PRL-3 siRNA的AN3 CA細(xì)胞穿透數(shù)目，與3個對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.001,表2，圖3d）。

圖3 PRL-3對子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

討 論

核磁共振分析發(fā)現(xiàn)，PRL-3是以單體形式存在，其二級結(jié)構(gòu)由1個5片β折疊和6個α螺旋組成，該排列和整體折疊方式為特異性磷酸酶所特有。但是圍繞PRL-3活性中心的疏水性氨基酸使得其有別于其他特異磷酸酶[8-9]。在正常組織中的表達(dá)具有高度特異性，它主要在骨骼肌和心肌中表達(dá)，其次是胰腺，而在腦、肺、肝、腎和胎盤等組織中未能檢測到其表達(dá)[10-11]。PRL-3的生理功能是調(diào)控血管緊張素-Ⅱ，以影響細(xì)胞間Ca2+的傳遞。后來發(fā)現(xiàn)，PRL-3在乳腺癌、卵巢癌、腸癌、肺癌和胃癌等腫瘤中呈高表達(dá)[1-7，12]，并與腫瘤轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。本研究用RT-PCR和Western方法檢測2種子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞HEC-1-B和AN3 CA中PRL-3的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中PRL-3表達(dá)水平較高。

在關(guān)于PRL-3生物學(xué)功能方面的研究中發(fā)現(xiàn)，PRL-3能促進(jìn)人宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[13]。另外，小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16高表達(dá)PRL-3后，其遷移和侵襲能力及伸展速度也明顯提高[14]。為了明確PRL-3在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中與遷移和侵襲能力的關(guān)系，用這兩株細(xì)胞HEC-1-B和AN3 CA細(xì)胞進(jìn)一步研究，在這兩株細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA PRL-3 24、36、48、60、72 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染36 h后PRL-3表達(dá)最低。然后，進(jìn)一步用transwell小室觀察了轉(zhuǎn)染36 h后，HEC-1-B細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA PRL-3的HEC-1-B細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低。為了驗(yàn)證PRL-3與子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞侵襲能力的關(guān)系，用同樣的方法觀察了AN3 CA細(xì)胞侵襲能力的改變。與HEC-1-B細(xì)胞侵襲能力改變相一致，轉(zhuǎn)染siRNA PRL-3的AN3 CA細(xì)胞的遷移和侵襲能力也降低。因此，PRL-3可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。

綜上所述，PRL-3在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且抑制其表達(dá)后能夠抑制子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。然而，PRL-3是通過什么途徑來影響子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的，它的靶基因及其靶位點(diǎn)又在哪里呢，這些還需要做更深層的研討，而研究將會為子宮內(nèi)膜腺癌的治療提供一個新的視點(diǎn)。

1 Saha S, Bardelli A, Buckhaults P, et al. A phosphatase associated with metastasis of colorectal cancer[J]. Science, 2001, 294(5545):1343-1346.

2 Wang Y, Li ZF, He J, et al. Expression of the human phosphatases of regenerating liver (PRLs) in colonic adenocarcinoma and its correlation with lymph node metastasis[J]. Int J Colorectal Dis, 2007, 22(10):1179-11784.

3 Pryczynicz A, Guzińska-Ustymowicz K, Chang XJ, et al. PTP4A3 (PRL-3) expression correlate with lymphatic metastases in gastric cancer[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2010, 48(4):632-636.

4 Wang L, Peng L, Dong B, et al. Overexpression of phosphatase of regenerating liver-3 in breast cancer: association with a poor clinical outcome[J]. Ann Oncol, 2006, 17(10):1517-1522.

5 Polato F, Codegoni A, Fruscio R, et al. PRL-3 phosphatase is implicated in ovarian cancer growth[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(19 Pt 1):6835-6839.

6 Kato H, Semba S, Miskad UA, et al. High expression of PRL-3 promotes cancer cell motility and liver metastasis in human colorectal cancer: a predictive molecular marker of metachronous liver and lung metastases[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(21):7318-7328.

7 Ming J, Liu N, Gu Y, et al. PRL-3 facilitates angiogenesis and metastasis by increasing ERK phosphorylation and up-regulating the levels and activities of Rho-A/C in lung cancer[J]. Pathology, 2009, 41(2):118-126.

8 Guzińska-Ustymowicz K, Pryczynicz A. PRL-3, an emerging marker of carcinogenesis, is strongly associated with poor prognosis[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2011, 11(1):99-108.

9 Al-Aidaroos AQ, Zeng Q. PRL-3 phosphatase and cancer metastasis[J]. J Cell Biochem, 2010, 111(5):1087-1098.

10 Zeng Q, Hong W, Tan YH. Mouse PRL-2 and PRL-3, two potentially prenylated protein tyrosine phosphatases homologous to PRL-1[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1998, 244(2):421-427.

11 Matter WF, Estridge T, Zhang C, et al. Role of PRL-3, a human muscle-specific tyrosine phosphatase, in angiotensin-Ⅱsignaling[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 283(5):1061-1068.

12 Miskad UA, Semba S, Kato H, et al. Expression of PRL-3 phosphatase in human gastric carcinomas:close correlation with invasion and metastasis[J]. Pathobiology, 2004, 71(4):176-184.

13 Bessette DC, Qiu D, Pallen CJ. PRL PTPs: mediators and markers of cancer progression[J]. Cancer Metastasis Rev, 2008, 27(2):231-252.

14 Wu X, Zeng H, Zhang X, et al. Phosphatase of regenerating liver-3 promotes motility and metastasis of mouse melanoma cells[J]. Am J Pathol, 2004, 164(6):2039-2054.

PRL-3 inhibits migration and invasion of endometrial adenocar cinoma cell lines

JIANG Guo-cheng, MING Jian, JIANG Yan-duo. Department of Information and Department of Pathology, No.202 Hospital of People Liberation Army of China, Shenyang 110000, China

JIANG Yan-duo, Email:ydjiang202@yahoo.com.cn

Objective To investigate the expression of PRL-3 in endometrial adenocarcinoma cell lines HEC-1-B and AN3 CA and the relationship between PRL-3 and the migration and invasion of endometrial adenocarcinoma cells.MethodsThe expression of PRL-3 in the endometrial adenocarcinoma cells after transfection were examined by RTPCR and Western Blot after a given period time (24 , 36 , 48 , 60 and 72 h after transfection with PRL-3 siRNA) was investigated. Meanwhile, we investigated the effect of PRL-3 on cell migration and invasion ability in endometrial adenocarcinoma cells by transwell. The t- test was used to compare the PRL-3 effect between control group and experimental group.ResultsThe results showed that PRL-3 was highly-expressed in endometrial adenocarcinoma cell lines. The lowest expression of PRL-3 occurred in the cells transfected with PRL-3 siRNA after 36h. Furthermore, downregulating PRL-3 in endometrial adenocarcinoma cells inhibited their their migration ability (the number of cells are 18.67 ± 7.49 and 15.96 ± 8.42 for HEC-1-B and AN3 CA respevtively, t = 5.23 ～ 6.45 and t = 3.32 ～ 5.33, P = 0.000 compare with control group) and invasion ability (the number of cells are 4.67 ± 0.98 and 3.89 ± 1.09 respectively,t = 4.86 ～ 6.98 and t = 4.36 ～ 5.64，P = 0.000, compare with control group,) .ConclusionsPRL-3 was highly-expressed in endometrial adenocarcinoma cells and down-regulating PRL-3 could inhibit cell migration and invasion.

2012-12-17)

(本文編輯：蔡曉珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.002

遼寧省科學(xué)基金博士啟動基金（20111122）

110000 沈陽，解放軍202醫(yī)院信息科（姜國成），病理科（明健、姜彥多）

姜彥多，Email：ydjiang202@yahoo.com.cn

姜國成，明 健，姜彥多. PRL-3促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞侵襲能力[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志：電子版, 2013, 3(2):61-65.