佘志剛等

摘 要：褐化是蘆薈組織培養(yǎng)中的普遍現(xiàn)象，嚴(yán)重影響組織培養(yǎng)的效果。以庫(kù)拉索蘆薈的莖段和葉片為外植體，研究了5種防褐劑活性炭、硝酸銀、維生素C、L-谷氨酰胺和聚乙烯吡咯烷酮對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)中褐化現(xiàn)象的抑制作用。結(jié)果表明，5種防褐劑都具有抑制外植體褐化的作用，其中15mg/L的AgNO3是最合適的防褐劑，其外植體褐化程度最輕，愈傷組織誘導(dǎo)率較高且愈傷組織生長(zhǎng)良好。

關(guān)鍵詞：庫(kù)拉索蘆薈；愈傷組織；褐化；防褐劑

中圖分類號(hào) Q949.71+8.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1007-7731（2013）06-23-02

庫(kù)拉索蘆薈（Aloe barbadensis）為百合科蘆薈屬多年生肉質(zhì)植物[1]，其葉肥厚多汁，富含多種活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)元素，如維生素、多糖、蒽醌類化合物，葉肉粘膠物質(zhì)占總?cè)~重的65%～75%，3a以上老葉藥效成分含量高，是藥用、保健、美容的主要品種。庫(kù)拉索蘆薈的常規(guī)繁殖速度慢，主要利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖，目前已經(jīng)開展了一些研究[1-7]。研究的結(jié)果表明，莖尖和莖段更容易產(chǎn)生不定芽，葉片外植體難以誘導(dǎo)分化，但是所有的外植體在組織培養(yǎng)中都會(huì)發(fā)生褐化現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致外植體或分化的組織器官死亡[4-7]。褐化影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，不利于后期次生產(chǎn)物積累的研究和種苗的快速繁殖。筆者在培養(yǎng)基中添加了不同的防褐劑[6-9]，探討防止外植體褐化的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料 3a生庫(kù)拉索蘆薈，購(gòu)于武漢雄楚大街花卉市場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 取庫(kù)拉索蘆薈的莖和葉片在自來(lái)水下沖洗干凈。選擇幼嫩葉片拋開晾2h，然后在無(wú)菌條件下用75%的酒精消毒30s，0.1%升汞處理10min，無(wú)菌水洗滌5～6次，切成約0.5cm×0.5cm的小片，接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。鱗莖用75%的酒精消毒30s，0.1%升汞處理15min，無(wú)菌水洗滌5～6次，切成約0.5cm×0.5cm×0.3cm的小塊，接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 庫(kù)拉索蘆薈愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，采用4因素3水平的正交設(shè)計(jì)，其中KT設(shè)置1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L 3個(gè)水平，2，4-D設(shè)置0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L 3個(gè)水平，NAA設(shè)置0.1mg/L、0.3mg/L、0.5mg/L 3個(gè)水平，6-BA設(shè)置1.0mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L 3個(gè)水平，培養(yǎng)基中添加2g/L活性炭抑制褐化。將消毒后的莖和葉片外植體接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種3個(gè)外植體，每處理3瓶。暗培養(yǎng)4d后24℃光照培養(yǎng)，2周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)情況，連續(xù)統(tǒng)計(jì)3周，以最適培養(yǎng)基進(jìn)行防褐化實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 防褐化實(shí)驗(yàn) 以1.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考，在MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別加入2g/L活性炭、15mg/L硝酸銀、0.2g/L維生素C（VC）、5mg/L L-谷氨酰胺、1.5g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP），組成5個(gè)防褐化處理，另設(shè)一組不加防褐化劑的空白對(duì)照，共6個(gè)處理。將消毒后的莖和葉片外植體接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種4個(gè)外植體，每處理3瓶。低溫8℃暗培養(yǎng)4d后，24℃暗培養(yǎng)3d，然后24℃弱光培養(yǎng)。每天觀察外植體生長(zhǎng)狀態(tài)，2周后統(tǒng)計(jì)外植體的褐化情況及愈傷組織誘導(dǎo)率，連續(xù)統(tǒng)計(jì)2周。

2 結(jié)果與分析

將外植體接種到含有不同防褐化劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，6d后外植體體積顯著增大，除葉外植體的AgNO3處理外，其他處理均出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，褐化程度不一，以空白對(duì)照的褐化程度最為嚴(yán)重，莖外植體的褐化程度顯著高于對(duì)應(yīng)的葉外植體。轉(zhuǎn)入弱光培養(yǎng)1周后，外植體色澤更綠而有光澤，4周漸漸有顆粒狀愈傷組織形成，外植體轉(zhuǎn)為黃綠色。3周時(shí)愈傷組織繼續(xù)生長(zhǎng)，4周時(shí)各處理的愈傷組織誘導(dǎo)率及褐化情況見表1和表2。

從表1和表2可以看出，在培養(yǎng)基中加入不同的附加物都可以有效抑制外植體的褐化，葉的褐化程度較莖輕。葉外植體的5種處理中，VC處理的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，但外植體褐化率較高，導(dǎo)致形成的愈傷組織體積??；AgNO3和谷氨酰胺處理的外植體褐化率降低，愈傷組織誘導(dǎo)率處于中等水平，但AgNO3處理的愈傷組織生長(zhǎng)迅速；活性炭和PVP處理的愈傷組織誘導(dǎo)率較低。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，AgNO3是最合適的防褐化劑。莖外植體的5種處理中，VC處理的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，愈傷生長(zhǎng)狀態(tài)較好，但外植體褐化率較高；AgNO3處理的外植體褐化率降低，褐化程度輕，愈傷組織生長(zhǎng)迅速但愈傷組織誘導(dǎo)率較低；谷氨酰胺處理的外植體褐化率低，愈傷組織誘導(dǎo)率高，但愈傷組織體積小。綜合各項(xiàng)指標(biāo)，VC和AgNO3都是較適合的防褐化劑。

3 討論

庫(kù)拉索蘆薈由于含有蒽醌類物質(zhì)在培養(yǎng)中容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)中加入的5種防褐化劑都可以減輕外植體的褐化，但效果不同，這是因?yàn)樗鼈兊淖饔脵C(jī)理不同。VC、AgNO3、L-谷氨酰胺屬于抗氧化劑，其通過降低蘆薈大黃酚等物質(zhì)的氧化達(dá)到防褐化效果，而活性炭和PVP是吸附劑，是通過吸附蒽醌類物質(zhì)達(dá)到防褐化效果。吸附劑在吸附褐化物質(zhì)的同時(shí)，也可吸附培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如激素，所以吸附劑的作用效果比抗氧化劑差。3種抗氧化劑中，VC和L-谷氨酰胺屬于生物活性物質(zhì)，AgNO3是重金屬，所以AgNO3的防褐化效果雖好，但同時(shí)抑制了愈傷組織的形成，其愈傷組織誘導(dǎo)率均低于VC和L-谷氨酰胺。由于次生產(chǎn)物的提取和種苗的克隆需要大量生長(zhǎng)狀態(tài)良好的愈傷組織，培養(yǎng)中愈傷組織的褐化程度將是最關(guān)鍵的指標(biāo)，愈傷組織誘導(dǎo)則可以通過擴(kuò)大初代培養(yǎng)外植體的數(shù)目加以改善，因此，AgNO3適合作為庫(kù)拉索蘆薈組織培養(yǎng)的防褐化劑。

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