楊艷玲　徐曉虹

摘要：增塑劑鄰苯二甲酸二乙基己酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是一種具有擬雌激素和抗雄激素活性的環(huán)境內分泌干擾物，人類和野生動物可通過不同途徑終生暴露于DEHP，母體攝入的DEHP可通過胎盤和乳汁轉入子代體內并進入腦組織。圍生期DEHP暴露性別特異性地改變子代大鼠下丘腦視前區(qū)芳香酶活性而影響雌激素合成，并通過改變雌激素受體活性干擾雌激素對腦發(fā)育的調節(jié)作用。DEHP及其代謝產物可以影響神經(jīng)細胞的增殖分化和突觸形成，干擾性激素調控發(fā)育過程中的下丘腦氨基酸遞質系統(tǒng)對促性腺激素釋放激素分泌的刺激作用，影響中腦多巴胺遞質系統(tǒng)發(fā)育而誘導自發(fā)性多動癥。DEHP對腦發(fā)育的作用最終影響動物的早期行為、學習記憶和情感等行為發(fā)育。

關鍵詞：鄰苯二甲酸二乙基己酯；神經(jīng)發(fā)育毒性；環(huán)境內分泌干擾物

分類號：B845

鄰苯二甲酸酯類（phthalate esters，PAEs）是一種廣泛使用的人工合成化合物，因大量用于增加塑料制品的柔韌性和耐用性而被稱為增塑劑，全球每年消耗量超過500萬噸。PAEs增塑劑中以鄰苯二甲酸二乙基己酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）的用量最大，約占總量的40%（singh&Li，2012）。由于DEHP最初被認為是無毒物質，多數(shù)國家的衛(wèi)生法規(guī)均無限制地許可其用于各種塑料產品。在聚氯乙烯（PVC）塑膜中，DEHP的用量高達30%-50%。此外，因其良好的溶解性、分散性和粘著性，DEHP還被廣泛使用于合成橡膠、涂料、黏合劑、化工合成等其他領域。DEHP與塑料分子間以氫鍵或范德華力相連，鍵能較弱，親脂性強，通過雨水的淋洗、遷移和蒸發(fā)等方式釋放到環(huán)境中（Wang&Dong，2012），使人類和野生動物終生暴露于不同來源的DEHP（Koch，Drexler，&Anger，2003；Australia，NICNAS，2007）。DEHP是一種脂溶性環(huán)境內分泌干擾物，其代謝產物結構與內源性雌激素具有一定的相似性，進入人和動物體內可影響內源性性激素的合成與代謝，并可與相應的激素受體結合，干擾內源性激素對機體許多生理活動的調節(jié)，因而對人和野生動物產生多方面不利影響，其中主要表現(xiàn)為生殖發(fā)育毒性（Piersma，Verhoef，te Biesebeek，Pieters，&Slob，2001；Swan，2008；Li&Zhang，2012）。DEHP的急性毒性小，大、小鼠的半數(shù)致死劑量（LDso）約為30g/kg，主要表現(xiàn)為低劑量慢性毒性。歐盟和美國基于動物實驗確定DEHP不影響人體健康的極限值（no observable adverse efiect level，NOAEL）為48 mg/kg/day，每日允許攝人量（tolerable dailyintake，TDI）為20 gg/kg/day（柯翔鴻，2008；Commission Regulation（EU）No 412/2012，2012）。然而，據(jù)美國毒物與疾病登記署（ATSDR）估算，普通人群經(jīng)消化道的DEHP最大日攝入量為2mg/kg（Koch et al.，2003；Shea，2003），平均暴露水平在3-30μg/kg/day（Kavlock et al.，2002），德國成人的DEHP的攝入范圍為0.03-173μg/kg/day（Fromme et al.，2007），這些值已超過人群所能耐受的慢性暴露水平（TDI，20μg/kg/day）；而職業(yè)暴露、醫(yī)療暴露和兒童的非飲食暴露量更大。醫(yī)療用品很多都含有DEHP，據(jù)2000年美國國家人類生育毒性研究報告，重癥監(jiān)護病房接受治療的患兒DEHP暴露水平可能是普通環(huán)境中成人暴露量的2-3個數(shù)量級（shea，2003；Guyto et al.，2009）。因此，2011年，歐盟將DEHP等3種PAEs增塑劑作為首批通過的《化學品注冊、評估、許可和限制》（REACH）需授權物質正式納入REACH法規(guī)授權名單，中國目前還無相關規(guī)定和標準。

人類主要通過食品、醫(yī)療用具、水體等途徑攝人DEHP，其中人體內超過90%的DEHP是從食品攝入（Wittassek&Angerer，2008）。經(jīng)口攝入的DEHP一部分以原形直接吸收，其余迅速代謝水解為有活性的單酯MEHP（mono ethylhexyl phthalate，MEHP）（Tickner，Schettler，Guidotti，McCally，&Rossi，2001），后者被認為是DEHP在體內發(fā)揮最終毒性效應的主要物質（Koch，Bolt，Preuss，&Angerer，2005；Stroheker et al.，2005）。DEHP在體內的半衰期為12h，而脂肪組織中長達156h（Parks et al.，2000；Australia，NICNAS，2003）。DEHP的生殖發(fā)育毒性已引起人們的廣泛關注，經(jīng)過長期大量的實驗動物和人體研究，目前已認定包括DEHP在內的PAEs增塑劑可干擾人和動物的內分泌系統(tǒng)，影響野生動物幼體的性腺分化和成體的生殖活動（Li and Zhang，2012），導致人類男性生殖能力減弱、引發(fā)女性性早熟（swan，2008）。此外，DEHP還具有一定的胚胎、免疫、肝臟毒性以及致癌作用。

動物的神經(jīng)系統(tǒng)從胚胎到成年均受性腺激素的調控，器官形成期是胚胎對外界化學物質最敏感的時期，也是神經(jīng)系統(tǒng)分化發(fā)育的關鍵期。母體攝入的DEHP可通過胎盤和乳汁進入子代體內，而生命早期未發(fā)育完全的血腦屏障，使DEHP很容易進入腦組織（xu，Agrawal，Cook，&Knipp，2007）。因此，具有擬雌激素和抗雄激素活性的DEHP有可能干擾內源性性激素對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調節(jié)，影響腦的性別分化和成年后的神經(jīng)活動，但目前人們對這方面的認識還很缺乏。下面就近來DEHP的神經(jīng)發(fā)育毒性研究進展做一簡要綜述。

1.DEHP對腦內芳香酶合成及雌激素受體活性的影響

在發(fā)育階段，卵巢及其他組織的雌激素分泌功能尚未建立，大腦是胎兒體內雌激素的唯一來源（董朝軒，關云謙，張愚，2006）。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，包括下丘腦視前區(qū)、皮質、海馬、中腦以及杏仁體等在內的大部分腦區(qū)神經(jīng)元都表達雌激素合成的關鍵酶——芳香酶（aromatase）（Beyer&Hutchison，1997），這些芳香酶可以催化雌激素合成。動物出生前后幾天，腦內芳香酶活性、雌激素、以及雌激素受體均達到最高水平，然后逐漸降低至成年水平（McCarthy，2008）。在發(fā)育過程中，芳香酶的表達具有時間、腦區(qū)和性別特異性，并因此影響腦內雌激素分布的時空和性別差異，從而調節(jié)腦發(fā)育的性別分化。有人認為，DEHP影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育可能是通過影響芳香酶開始的，經(jīng)抑制芳香酶P450基因（CYP19）的表達而影響腦內雌激素代謝（Lovekamp-Swan&Davis，2003）。Andrade，Grande，Talsness，Grote和Chahoud（2006）觀察了DEHP對子代大鼠下丘腦視前區(qū)的芳香酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段暴露于DEHP對雌性和雄性子代動物產生不同的影響，并與暴露劑量有關。具體而言，圍生期母體暴露于低劑量（0.015-1.215mg/kg/day）DEHP抑制1日齡雄性仔鼠的芳香酶活性，而暴露于較高劑量（5-405mg/kg/day）DEHP卻增加其活性，但雌性仔鼠芳香酶活性不受影響。與此相反，生后22天，高低劑量DEHP對雌性仔鼠芳香酶活性的影響遠大于雄性，無論高低劑量均使雌鼠的活性增加，但只有一個低劑量（0.405mg/kg/day）DEHP增加雄鼠的芳香酶活性。由此可見，圍生期DEHP暴露對子代腦內雌激素合成的影響具有發(fā)育階段和性別的特異性。

雌激素參與腦發(fā)育過程的許多環(huán)節(jié)，包括神經(jīng)細胞凋亡、存活、細胞分化的關鍵步驟和神經(jīng)回路的形成（McCarthy，2008）。雌激素在腦發(fā)育中的作用存在腦區(qū)差異，在某些腦區(qū)雌激素促進神經(jīng)細胞凋亡和突觸形成，而在另一些腦區(qū)則相反。發(fā)育過程中，神經(jīng)系統(tǒng)表達雌激素a和B受體（ERα和ERβ），細胞內外的雌激素信號可通過這些受體影響神經(jīng)細胞的活動（Weiser，F(xiàn)oradori，&Handa，2008）。體外研究表明，根據(jù)濃度不同，DEHP即可以激活ER而表現(xiàn)出雌激素效應，也可以拮抗17β-雌二醇與ER的結合而表現(xiàn)出抗雌激素效應（Ghisari&Bonefeld-Jorgensen，2009）。因此，DEHP可能一方面通過改變腦內雌激素水平，另一方面通過改變神經(jīng)細胞雌激素受體活性而干擾雌激素對腦發(fā)育的調節(jié)作用。

2.DEHP對腦形態(tài)結構發(fā)育的影響

DEHP的代謝產物MEHP可通過影響細胞增殖與分化而干擾神經(jīng)細胞發(fā)育。在神經(jīng)生長因子（NGF）誘導PCI2細胞系分化的進程中，MEHP（2.5-250μM）暴露4天可增加膜蛋白和細胞骨架蛋白的含量，促進NGF誘導的神經(jīng)突起生長，上調膽堿乙?；D移酶mRNA表達，卻下調酪氨酸羥化酶mRNA的水平，顯示出促進神經(jīng)細胞從多巴胺（dobamine，DA）表型向乙酰膽堿（acetylcholine，Ach）表型分化的現(xiàn)象（chen，Yang，Li，Chen，&Xu，2011）。

雌激素參與調節(jié)神經(jīng)元樹突棘和突觸的發(fā)育過程以及神經(jīng)回路的形成。胚胎時期大鼠腦皮層發(fā)育有三個重要階段：E14，神經(jīng)元細胞開始形成期；E18，膠質細胞開始形成期；E20，出生前腦發(fā)育穩(wěn)定期。與成年個體相比，發(fā)育中的腦對環(huán)境刺激更加敏感，因為胚胎外胚層的一個小條帶即可發(fā)育成含有上萬個細胞并具精確組織形式的復雜器官，加之發(fā)育中的血腦屏障尚未完善，母體DEHP暴露可影響胎兒或新生兒的腦發(fā)育。受孕第8天的母體暴露于DEHP可導致大鼠胚胎神經(jīng)管發(fā)育畸形，主要表現(xiàn)為腦膨出和露腦（蔡林強，2007）。在母體妊娠第8-17天和仔鼠出生后第3-7天暴露于1mg/kg/day DEHP可降低2周齡小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目和6周齡小鼠的腦重（Tanida et al.，2009）。妊娠期和哺乳期DEHP暴露還可損傷子代雄性大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的性別發(fā)育，這些仔鼠在生殖器官發(fā)育正常的情況下表現(xiàn)出生殖行為無能（Moore，Rudy，Lin，Ko，&Peterson，2001）。生后早期，大腦還要經(jīng)歷突觸發(fā)生和重塑、髓鞘形成等重要過程。Smith，Macdonald和Holahan（2011）發(fā)現(xiàn)，在出生后第16-22天這一海馬發(fā)育的敏感時期暴露于DEHP（10mg/kg）可降低雄性大鼠海馬CA3區(qū)的軸突標記物水平，同時還減少齒狀回（DG）和CA3區(qū)未成熟和成熟神經(jīng)元的密度，但對雌性大鼠海馬形態(tài)結構發(fā)育沒有影響。這些結果顯示，發(fā)育期DEHP暴露不僅影響腦形態(tài)發(fā)育和分化，還可影響成年后的大腦組織結構和功能。

3.DEHP對腦內遞質系統(tǒng)和神經(jīng)內分泌的影響

腦是神經(jīng)活動的結構基礎，而神經(jīng)遞質在腦功能活動中起信息傳遞的關鍵作用。腦內各遞質系統(tǒng)的發(fā)育表現(xiàn)出時空變化，雌激素在這個過程中起重要的調節(jié)作用，而DEHP可干擾雌激素對腦內遞質系統(tǒng)發(fā)育的調節(jié)。

3.1對下丘腦氨基酸遞質和神經(jīng)內分泌的影響

神經(jīng)和內分泌是兩個關系密切又互相影響的系統(tǒng)，在發(fā)育的性別分化過程中，下丘腦氨基酸遞質系統(tǒng)對神經(jīng)元分泌促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）起重要的調節(jié)作用。興奮性氨基酸天門冬氨酸（Asp）可刺激GnRH分泌，而抑制性氨基酸γ-氨基丁酸（GABA）則相反，并最終調節(jié)促性腺激素FSH的釋放。圍生期DEHP暴露可以通過下丘腦一垂體系統(tǒng)調節(jié)神經(jīng)遞質及相關激素水平而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。妊娠期和哺乳期暴露于30mg/kg/dayDEHP在降低青春期雄性大鼠（30日齡）睪丸重量和血清FSH水平的同時，提高下丘腦GABA水平而降低Asp水平，因此抑制了氨基酸對促性腺激素的刺激效應（carbone et al.，2010）。而從妊娠始至生后15天DEHP暴露影響青春期前（15日齡）雌、雄仔鼠生殖相關的神經(jīng)內分泌活動。與對青春期雄性大鼠的作用相反，DEHP降低了青春期前雄性仔鼠下丘腦GABA水平，卻增加了Asp水平；而對青春期前雌性仔鼠下丘腦GABA和Asp水平均有增加作用，這些變化促進了氨基酸對青春期前雌、雄仔鼠促性腺激素的刺激效應（Carbone et al.，2012）。這一發(fā)現(xiàn)為DEHP對下丘腦氨基酸神經(jīng)遞質和神經(jīng)內分泌的影響提供了新證據(jù)，同時也為DEHP生殖毒性機制的研究提供了新思路。

3.2對多巴胺遞質系統(tǒng)的影響

腦內多巴胺（Dopamine，DA）遞質系統(tǒng)參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括運動，認知、動機和獎賞、情緒和注意力等許多活動的調節(jié)。環(huán)境內分泌干擾物可影響多巴胺遞質系統(tǒng)而改變神經(jīng)行為。5日齡雄性大鼠腦室注射DEHP，在4-5周齡時出現(xiàn)明顯的自發(fā)性多動癥（motor hyperactivity），其夜間活動性增加1倍多；到8周齡時紋狀體和中腦的多巴胺受體D1A基因和甘丙肽受體2基因表達降低，而多巴胺受體D2基因表達增加（Ishido，Morita，Oka，&Masuo，2005），表明DEHP可能抑制了多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育。為了研究環(huán)境內分泌干擾物引起多動癥的機制，Masuo，Morita，Oka和Ishido（2004）比較了內分泌干擾物和6-羥多巴胺（6-OHDA）誘導的多動癥模型的差異，發(fā)現(xiàn)6-OHDA誘導的4-5周齡大鼠夜間表現(xiàn)出嚴重的多動癥，而內分泌干擾物（雙酚A、壬基酚、DEHP）誘導的大鼠表現(xiàn)出更為嚴重的多動癥癥狀，除了夜間，白天也表現(xiàn)出明顯增多的自發(fā)活動。進一步分析發(fā)現(xiàn)，內分泌干擾物和6-OHDA誘導的多動癥在紋狀體和中腦的基因表達改變明顯不同：DEHP改變了中腦編碼G蛋白偶聯(lián)受體的基因表達水平。這些結果表明，發(fā)育期6-OHDA與DEHP誘導成年大鼠多動癥的機制不同，DEHP誘導大鼠多動癥可能涉及與多巴胺神經(jīng)轉導以及許多肽能神經(jīng)轉導相關的G蛋白偶聯(lián)受體基因表達水平的改變（Ishido et al.，2005）。

3.3對甲狀腺激素分泌的影響

甲狀腺激素（Thyroid hormone，TH）是調節(jié)機體尤其是大腦發(fā)育的重要激素，參與大腦成熟過程的多個基因均受TH的調節(jié)（Bernal，2005）。在胚胎至新生兒這一神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關鍵時期，TH水平異常將導致不可逆轉的精神發(fā)育遲滯和神經(jīng)功能障礙。包括DEHP在內的PAE類增塑劑和酚類物質可影響TH依賴的大鼠腦垂體腫瘤細胞株GH3的增殖（Ghisari&Bonefeld-Jorgensen，2009）；DEHP暴露的大鼠甲狀腺組織發(fā)生病理學改變，血漿中游離甲狀腺素（T4）濃度降低（Botelho et al.，2009）；而大鼠靜脈注射相當于輸血過程中從PVC血袋浸出量水平的DEHP后，血清中T4和T3水平增加（王佳，董四君，2012）?？梢奃EHP可擾亂體內甲狀腺組織活動，改變體內TH水平而影響腦的發(fā)育。

4.DEHP對神經(jīng)細胞鈣離子的影響

最近，應用電生理技術對DEHP在果蠅投射神經(jīng)元突觸前傳遞中作用的研究發(fā)現(xiàn)，DEHP（100μM）可影響果蠅觸角葉投射神經(jīng)元的自發(fā)電活動，降低自發(fā)性放電頻率和微小興奮性突觸后電流（mEPSCs）的頻率和振幅，同時DEHP抑制了鈣通道振幅的峰值（Ran，Cai，Wu，&Gu，2012）。這些結果提示DEHP可能通過抑制鈣通道活動改變果蠅觸角葉投射神經(jīng)元突觸前傳遞，同時也提示神經(jīng)遞質系統(tǒng)可能是DEHP作用的靶點。而Tully，Kuofer Dopico和Treistman（2000）首次報道了DEHP對神經(jīng)組織鈣離子動力學的急性效應。他們發(fā)現(xiàn)急性暴露于從靜脈注射器溶出的含DEHP（～800nM）的混合液可導致大鼠神經(jīng)末梢和嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）內鈣離子水平增加。劉艷華等也發(fā)現(xiàn)圍生期母體暴露于10-500mg/kg/dayDEHP的仔鼠出生后21天表現(xiàn)出海馬神經(jīng)元細胞內Ca2+升高，并且存在一定劑量效應關系（劉艷華等，2011）。細胞內鈣在神經(jīng)細胞活動中發(fā)揮重要作用，包括調節(jié)興奮性、神經(jīng)遞質釋放和細胞內信號蛋白活動。DEHP導致的神經(jīng)元胞內鈣離子濃度改變可能是神經(jīng)發(fā)育毒性的一個重要機制。

5.DEHP對神經(jīng)行為的影晌

神經(jīng)行為是神經(jīng)系統(tǒng)功能活動的最終體現(xiàn)，各種因素誘導的神經(jīng)元形態(tài)結構、神經(jīng)環(huán)路和遞質系統(tǒng)等變化均有可能改變神經(jīng)行為。因此，環(huán)境內分泌干擾物很容易因干擾腦內雌激素的活動而影響神經(jīng)行為的發(fā)育。

從F0代小鼠5周齡始至F1代9周齡止，在食物中添加DEHP（7-70mg/kg/day）可影響F1代雌、雄小鼠的早期行為發(fā)育，表現(xiàn)為中低劑量DEHP延遲4日齡雌性仔鼠的翻正反射（surfacerighting reflex），中高劑量DEHP抑制7日齡雄性仔鼠的翻正反射（Tanaka，2002）。圍生期DEHP暴露也有類似作用，從妊娠始至孕19天連續(xù)暴露于500 mg/kg/day DEHP的大鼠其所生仔鼠的負趨地性反射（negative geotaxis reflex）和空中翻正反射（air righting reflex）延遲（劉艷華等，2011）。此外，生后5天暴露于DEHP還會誘導青春期雄性大鼠的多動癥，夜間活動性增加l倍以上（Ishido et al.，2005）。這些行為缺陷均表現(xiàn)出雄性大于雌性的現(xiàn)象。

學習記憶和情感是腦的高級神經(jīng)功能。大鼠從妊娠日始至孕19天暴露于100-500 mg/kg/dayDEHP，將延長6周齡仔鼠在水迷宮中尋找平臺的潛伏期（劉艷華等，2011），增加穿梭箱實驗中遭電擊次數(shù)并延長主動逃避電擊的潛伏期（劉艷華等，2011；潘亮等，2012）。妊娠7-16天暴露于250、750、1000mg/kg/day DEHP明顯增加斷乳（21日齡）仔鼠在跳臺實驗中遭電擊后跳下平臺的錯誤次數(shù)，縮短遭電擊后的步下潛伏期，縮短在避暗實驗中遭電擊后的步入潛伏期（張晶瑩，宋昕恬，孟令儀，2012）。但在斷乳后暴露于10-1000mg/kg/day DEHP兩周對雄性大鼠水迷宮的空間學習記憶沒有影響（逯曉波等，2008）。這些研究表明，DEHP影響包括空間記憶、被動回避和主動回避等多種學習記憶行為；而圍生期DEHP暴露對學習記憶的影響更顯著，不僅影響子代幼年時的學習記憶行為還可影響動物成年后的遠期學習記憶功能。此外，DEHP還影響動物的情感活動。初斷乳雄性小鼠暴露于5-500mg/kg/day DEHP10天后，與正常對照組相比，強迫游泳實驗中靜止不動的時間明顯延長，表明DEHP可誘發(fā)幼年小鼠的抑郁樣行為（周佩等，2012）。

目前，有關DEHP暴露對人類神經(jīng)行為影響的研究十分有限。Yolton，Xu，Strauss，Altaye，Calafat和Khoury（2011）測定了美國350名孕婦在懷孕16周和26周時尿液中雙酚A和PAEs含量，并與其所產嬰兒在5周歲之前的健康狀況進行比對。結果發(fā)現(xiàn)，PAEs與嬰兒的神經(jīng)行為有關聯(lián)，作用效果取決于PAEs的類型，尿液中較高水平的DEHP影響26周男嬰的反射功能?；谌巳旱牧餍胁W研究結果表明，尿液中DEHP代謝產物MEHP的濃度與兒童的行為相關（Engel et al.，2009）。學齡兒童尿液中PAEs代謝物含量與其智商成反比（Cho et al.，2010），與注意缺陷多動癥（attention deficit hyperactivi哆disorder）呈正相關關系（Kim et al.，2009），而DEHP誘導青年大鼠多動癥的發(fā)現(xiàn)為此提供了證據(jù)（Ishido et al.，2005）。

6.結語

由于PAEs增塑劑的廣泛使用，DEHP已成為環(huán)境中普遍存在的持久性有機污染物，人類和動物可經(jīng)多種途徑終生暴露于DEHP。盡管其毒性較低，且進入體內后大多可被代謝，但越來越多的研究表明，DEHP對人和動物的多個系統(tǒng)及其發(fā)育存在潛在的危害。目前，大多數(shù)DEHP毒性研究主要集中在生殖發(fā)育毒性的動物實驗，而根據(jù)以上這些來自實驗動物和人類的研究結果可以推測DEHP可能影響人類大腦的發(fā)育，但目前人們對這方面的認識還很缺乏。因此，今后可在DEHP影響腦和行為發(fā)育的機制和人群流行病學方面開展研究，為DEHP的毒性防治和今后DEHP環(huán)境排放新標準的制定提供科學依據(jù)。