師希雄 余群力 黨欣

摘 要：以10頭甘南牦牛為研究對象，對宰后8d 成熟期間肌原纖維小片化指數(shù)、剪切力、肌纖維直徑、μ-鈣蛋白酶（μ-calpain）、m-鈣蛋白酶（m-calpain）、鈣蛋白酶抑素（calpastatin）的活力進(jìn)行了測定，同時研究了3種酶活力與肌原纖維小片化指數(shù)、剪切力、肌纖維直徑3個嫩度指標(biāo)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3種酶與剪切力值及肌纖維直徑均呈正相關(guān)；3種酶與肌原纖維小片化指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，其中μ-calpain與calpastatin呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。因此，鈣激活酶活力的變化可能導(dǎo)致了肌原纖維小片化指數(shù)的增加，肌原纖維的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要貢獻(xiàn)者。

關(guān)鍵詞：牦牛肉；成熟；鈣激活酶；嫩度

中圖分類號：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2013）06-0001-04

肉的嫩度是所有肉品質(zhì)中最重要的指標(biāo)之一，它將決定肉是否被重復(fù)購買[1-2]。成熟是改善肉嫩度的有效方法之一。肉的最終嫩度取決于由內(nèi)源蛋白酶引起的肌原纖維結(jié)構(gòu)改變和弱化的程度，這些內(nèi)源蛋白酶包括鈣激活酶、組織蛋白酶、細(xì)胞凋亡酶、蛋白酶體等[3]。目前，普遍認(rèn)為，鈣激活酶在肉的嫩化中起著重要的作用[4]。骨骼肌中的鈣蛋白酶包括鈣蛋白酶1（μ-calpain）、鈣蛋白酶2（m-calpain）、鈣蛋白酶3（p94）以及鈣激活酶的內(nèi)源性的專一抑制蛋白（calpastatin）[5]。

李誠等[6]研究表明，杜長大三元雜交豬的背最長?。╨ongissimus dorsi，LDM）、腰大?。╬soas major，PM）兩種不同部位豬肉在宰后0～4℃冷卻成熟過程中鈣蛋白酶粗酶液活性、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibril fragmentation index，MFI）和剪切力之間呈現(xiàn)較高的相關(guān)性。田甲春等[7]研究發(fā)現(xiàn)，青海牦牛肉成熟過程中MFI 和鈣激活酶活性相關(guān)性極顯著，與組織蛋白酶L活性相關(guān)性顯著，鈣激活酶活性與組織蛋白酶L活性呈顯著負(fù)相關(guān)。郭兆斌等[8]研究了甘南牦牛肉成熟過程中食用品質(zhì)、鈣激活酶粗酶活性、肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。關(guān)于宰后牦牛肉成熟過程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的變化報道極少，特別是甘南牦牛肉成熟過程中μ-calpain，m-calpain及calpastatin的變化及其與嫩度指標(biāo)的相關(guān)性未見報道。本實驗旨在研究甘南牦牛肉宰后成熟過程中μ-calpain、m-calpain及calpastatin的變化及其與嫩度指標(biāo)的相關(guān)性，以便為構(gòu)建牦牛肉嫩度的預(yù)測模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

隨機選取甘南藏族自治州夏河縣，自然放牧條件下，發(fā)育正常健康無病、年齡3歲左右的黑牦牛12頭，進(jìn)行屠宰，宰后牦牛的背最長肌立即被移除，分割成平均質(zhì)量為50g的樣品，帶回實驗室，在0～4℃的條件下成熟0、1、3、5、7、8d，不同成熟時間點收集的樣品，一部分在-80℃的條件下冷凍用于測定鈣激活酶的活性，另一部分測定剪切力、肌原纖維小片化指數(shù)及肌纖維直徑。酪蛋白、Tris、MCE、亮肽素、PMSF、卵類黏蛋白抑制劑、EDTA均購自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

C-LM型數(shù)顯式肌肉嫩度儀 北京陽光億事達(dá)貿(mào)易有限公司；PPS-2蛋白純化系統(tǒng) 上海金達(dá)生化儀器公司；XSP-8CA顯微鏡 上海光學(xué)儀器一廠。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維小片化指數(shù)測定

參考Kriese等[9]的方法進(jìn)行測定。

1.3.2 剪切力測定

沿著肌纖維方向取厚度3cm的肉樣，在80℃水浴鍋中恒溫加熱至肉樣中心溫度達(dá)75℃，取出冷卻至室溫后，用直徑1.27cm的取樣器沿肌纖維方向鉆取3個肉柱測定樣，用嫩度儀測定剪切力值，剪切力值以N表示。每個肉樣平行測定3次，取平均值。

1.3.3 肌纖維直徑測定

參考李鵬等[10]的方法，取背最長肌的中央部位 3cm×2cm×1cm肉塊3塊，浸泡到1：10（V/V）甲醛溶液中，然后在10×40倍顯微鏡下隨機計數(shù)200根肌纖維直徑，求其平均值。

1.3.4 鈣激活酶活性的測定

1.3.4.1 酶的分離與純化

參考Delgado等[11]的方法并稍做改動。取宰后不同時間點的牦牛肉樣品，準(zhǔn)確記錄其質(zhì)量，絞碎后于4℃勻漿，加入150mL抽提液（pH8.3、100mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，10mmol/L β-巰基乙醇（MCE），100mg/L 卵類黏蛋白抑制劑，2mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），5mg/L亮抑酶肽），以勻漿3min，間隔3min模式運行，共5次。然后離心（4℃，18000×g，120min），去沉淀，取上清，并以0.45μm針式濾膜過濾。對過濾后的上清?。∟H4）2SO4分級沉淀部分，用25mL勻漿緩沖液溶解沉淀部分并用25倍體積的透析液（4℃，40mmol/L Tris-HCl，pH7.35；5mmol/L EDTA；10mmol/L MCE）進(jìn)行透析。透析后的溶液離心（4℃，18000×g，60min）取上清，并以0.45μm針式濾膜過濾后上柱。

DEAE-Sephacel離子交換柱（1.6cm×20cm），首先用平衡緩沖液（TEMA）（4℃，50mmol/L Tris-HCl，pH7.5；0.5mmol/L EDTA；10mmol/L MCE）進(jìn)行平衡，用TEMA將雜蛋白洗脫至基線，目標(biāo)蛋白用0→400mmol/L NaCl的TEMA溶液進(jìn)行線性梯度洗脫，流速0.5mL/min，每管3mL被收集，calpastatin在20～110mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來，μ-calpain在110～165mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來，m-calpain在220～330mmol/L NaCl濃度的范圍被洗脫下來。

1.3.4.2 鈣激活酶活性測定

參考Morton等[12]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并用Duncan 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后牦牛肉成熟過程中鈣激活酶活性的變化

由表1可知，在宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain的活性在宰后5d之內(nèi)顯著降低，5d后，μ-calpain活性變化不顯著，m-calpain的活性在宰后1d之內(nèi)稍有降低，之后，變化不顯著，calpastatin的活性在宰后3d內(nèi)差異不顯著，3d之后活性不斷降低。3種酶在宰后成熟過程中的變化趨勢與Delgado等[11]的報道基本一致。

μ-calpain與m-calpain需要足夠的鈣離子才能激活，激活后酶將遭受自溶，μ-calpain的自溶導(dǎo)致了酶的不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致了活力的喪失[13]。calpastatin活力的降低是由于鈣激活酶抑制蛋白多肽的降解造成的[14]。

2.2 宰后牦牛肉成熟過程中嫩度指標(biāo)的變化

2.2.1 剪切力值的變化

肉的嫩度又稱為肉的柔軟性，指肉在食用時口感的老嫩，反映了肉的質(zhì)地。它在本質(zhì)上取決于肌纖維直徑、肌纖維密度、肌纖維類型、肌纖維完整性、肌內(nèi)脂肪含量、結(jié)締組織含量及類型等[15]。肉嫩度評定最常用的方法是用嫩度儀測定剪切力，剪切力值越低，肌肉越嫩。圖1反映宰后牦牛肉在成熟8d的過程中剪切力值的變化，在宰后0～3d內(nèi)，剪切力值顯著升高，在3～5d內(nèi)，剪切力值顯著降低，7d后變化不顯著。最初剪切力值的逐漸增加是肌肉僵直的典型特征，隨后剪切力值的逐漸變小是逐漸成熟的過程[16]。

2.2.2 肌原纖維小片化指數(shù)

肌原纖維小片化指數(shù)是反映肌原纖維蛋白降解程度的有用標(biāo)志，MFI值越大表明降解的越多，肉會變得越嫩[17]。從圖2可以看出，肌原纖維小片化指數(shù)呈現(xiàn)顯著增加的趨勢，在前3d增加的速度較快，3d后增加的速度有所降低，成熟5d后不再發(fā)生顯著變化。牦牛肉成熟過程中肌原纖維小片化指數(shù)的變化趨勢與Watanabe等[18]的研究結(jié)果相一致。

2.2.3 肌纖維直徑

圖3反映了宰后牦牛肉成熟過程中，肌纖維直徑的變化，在宰后0d時，肌纖維直徑為48.23μm，隨著成熟時間的延長，不斷降低，前3d變化不顯著，后5d明顯降低，但是第7天與第8天差異不顯著。

肌纖維直徑是決定肉嫩度的重要因素，肌纖維越細(xì)，肌纖維密度越大，系水力越強，表現(xiàn)為肉質(zhì)細(xì)嫩，在成熟過程中，由于肌纖維與肌內(nèi)膜發(fā)生分離及汁液的流失，導(dǎo)致肌纖維直徑下降[19]。

2.3 鈣激活酶與嫩度指標(biāo)的相關(guān)性

表2反映了宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3種鈣激活酶與剪切力、肌纖維直徑、MFI 3個嫩度指標(biāo)之間的相關(guān)性。從表2可以看出，μ-calpain、m-calpain、calpastatin與剪切力值、MFI均呈正相關(guān)性，但是，相關(guān)性不顯著；3種酶均與肌原纖維小片化指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，其中，μ-calpain與calpastatin呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。由此可以推斷，鈣激活酶活力的變化可能導(dǎo)致了肌原纖維小片化指數(shù)的增加，肌原纖維的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要貢獻(xiàn)者。

3 結(jié) 論

3.1 宰后牦牛肉成熟過程中，μ-calpain與calpastatin的活力顯著降低，m-calpain活力稍有降低；剪切力值先增大后減小，肌原纖維直徑顯著降低，MFI顯著增加。

3.2 μ-calpain、m-calpain、calpastatin 3種酶與剪切力值及肌纖維直徑均呈正相關(guān)，與肌原纖維小片化指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，其中，μ-calpain與calpastatin呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，鈣激活酶活力的變化可能導(dǎo)致了肌原纖維小片化指數(shù)的增加，肌原纖維的弱化和肉的嫩化，μ-calpain可能是牦牛肉嫩化的主要貢獻(xiàn)者。

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