張成廣　劉啟兵

【摘 要】為檢測注射用特立帕肽對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松動物模型的保護作用，評價其與進口制劑體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松生物活性的一致性，選取健康Sprague Dawley大鼠，分別設立假手術組、模型組、注射用特立帕肽手術組，特立帕肽對照品手術組。連續(xù)給藥16周后，評價其對實驗動物大鼠各組脛骨密度值（bone mineral density，BMD）、股骨力學改變以及血清中ALP活力、鈣磷含量變化的影響，結(jié)果表明注射用特立帕肽給藥組可明顯改善骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度及骨力學性能，部分逆轉(zhuǎn)ALP活力的升高及血清鈣磷的降低，且其體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松活性與上市對照品基本一致，提示注射用特立帕肽在動物體內(nèi)有較好的抗骨質(zhì)疏松活性。

【關鍵詞】注射用特立帕肽；骨質(zhì)疏松；去卵巢；大鼠

【中圖分類號】R977 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2013）06-0010-02

骨形成促進藥在骨質(zhì)疏松治療中的地位越來越受到關注，特別是對于老年人和骨量低的人群，更需要用促進骨形成的藥物來增加骨量。特立帕肽（Teriparatide）商品名為Forteo，由禮來公司研制開發(fā)，2002年12月在美國首次上市，為重組人甲狀旁腺激素（rhPTH ）1-34，與內(nèi)源性PTH類似，可與特異性高親和性細胞表面受體結(jié)合發(fā)揮生物學作用[1]。動物實驗表明，本品一日1次給藥對成骨細胞的刺激作用高于其對破骨細胞的作用，可引起小梁骨和皮質(zhì)骨表面的新骨生成[2]。

海南雙成制藥有限公司采用固相合成的方法制備了特立帕肽原料藥，并采用凍干工藝制備了可供皮下注射的注射用特立帕肽（Teriparatide for injection），但自行制備的注射用特立帕肽的體內(nèi)生物活性即對動物骨質(zhì)量和生物力學性能的影響如何尚未加以確認。

依據(jù)藥品審評中心2007 年9 月《合成多肽藥物藥學研究技術指導原則》[3]， 為更好驗證注射用特立帕肽的體內(nèi)生物活性，我們利用大鼠雙側(cè)卵巢摘除（OVX）致骨質(zhì)疏松癥模型，以上市原研產(chǎn)品為對照，對實驗動物大鼠各組脛骨密度值（bone mineral density，BMD）、股骨力學改變以及血清中ALP活力、鈣磷含量變化進行了比較，考察了注射用特立帕肽抗骨質(zhì)疏松的體內(nèi)活性，并驗證其與上市原研產(chǎn)品活性的一致性，為進一步評價其臨床療效提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1藥物

注射用特立帕肽：海南雙成藥業(yè)提供，批號分別為20100601、20100602、20100603，規(guī)格：20g；特立帕肽對照品：Eli Lilly and Company的上市產(chǎn)品Forteo，規(guī)格：600mg/2.4ml。

1.2實驗動物

健康Sprague Dawley大鼠，體重（250±35）g左右，雌性，SPF級，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心。按照清潔級別飼養(yǎng)管理，自由飲用消毒自來水，飼料為標準顆粒飼料，黑白光照各12小時，自由活動。

1.3主要試劑及儀器

0.9%注射用生理鹽水（國藥準字：H33021037）、10% 水合氯醛；電子天平、 注射器、手術器械、骨密度測量儀（美國GE Lunar公司）、Zwick/Roell骨力學測量儀。

2 實驗方法

2.1實驗動物分組及給藥劑量

實驗大鼠48只，隨機分為6組，分別設立假手術組、模型組、注射用特立帕肽手術組，特立帕肽對照品手術組進行活性評價。根據(jù)進口特立帕肽陽性藥臨床單次劑量（20 μg/60 kg，人）折算得大鼠的單次給藥劑量為1.786 μg /kg，即1.786 ml /kg（1g/ml）。

2.2 雙側(cè)卵巢摘除致骨質(zhì)疏松模型建立[4]

用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（0.32ml/100g），進行雙側(cè)卵巢摘除手術，然后逐層縫合、消毒，做好術后護理。手術兩周后，對各個實驗組大鼠進行皮下給藥1.786 μl /kg，其中假手術組和模型組給予相應的生理鹽水。

2.3生物樣本處理[5]

持續(xù)給藥16周后，處死大鼠取其脛骨和股骨并檢測相關的指標，主要有各組脛骨密度值（bone mineral density，BMD）比較、各組骨力學比較以及血液中ALP活力、鈣磷含量變化。具體方法為：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打開腹腔后進行下腔靜脈取血，靜置1～2小時后4℃離心（3000rpm/min，15min）得血清，考察ALP、鈣磷含量變化；分離出大鼠左右脛骨和股骨并用浸泡過生理鹽水的紗布各自包裹，置于-40℃冰箱中保存，待檢測。

3 活性評價

3.1脛骨BMD比較

骨密度儀可給出測定對象的骨密度值（bone mineral density，BMD），常以g/cm 表示，基本含義是將當前骨礦物質(zhì)（BMC）的數(shù)量除以被礦物質(zhì)占據(jù)的骨投影區(qū)域（區(qū)域）的面積。卵巢摘除致骨質(zhì)疏松癥大鼠經(jīng)過6周給藥后，考察其各組脛骨密度值（bone mineral density，BMD）變化。

結(jié)果表明，手術組骨質(zhì)疏松的大鼠脛骨密度BMD為 0.1495±0.0061 g/cm2，與假手術組相比有顯著性差異。給予不同批次受試藥特立帕肽后BMD均得到顯著性改善，與手術組相比具有統(tǒng)計學差異。結(jié)果詳見表1。

4 討論

特立帕肽為重組人甲狀旁腺激素（rhPTH ）1-34，與內(nèi)源性PTH類似，可與特異性高親和性細胞表面受體結(jié)合發(fā)揮生物學作用[6]。動物實驗表明，本品一日1次給藥對成骨細胞的刺激作用高于其對破骨細胞的作用，可引起小梁骨和皮質(zhì)骨表面的新骨生成。

為確認自行制備的注射用特立帕肽體內(nèi)生物活性，特選擇去卵巢大鼠檢測其對動物骨質(zhì)量和生物力學性能的影響。去卵巢大鼠是研究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制和觀察藥物療效的經(jīng)典動物模型，雌性大鼠卵巢切除后，松質(zhì)骨的骨轉(zhuǎn)換加快，骨量減少，骨強度下降，這種特點類似于人骨質(zhì)疏松癥的骨丟失狀態(tài)[7，8]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予去卵巢大鼠皮下注射不同批次生產(chǎn)的注射用特立帕肽16周后，其脛骨BMD及生物力學強度的各項指標較手術組明顯升高，與假手術組相近。

堿性磷酸酶（ALP）是參與骨代謝的重要蛋白，與血漿中的鈣磷水平一樣，都是反應成骨細胞活性的主要指標[9，10]。因此，測定血中鈣磷物質(zhì)的含量及ALP活性水平對于了解骨代謝情況具有重要價值。本實驗結(jié)果顯示，去卵巢16周后，手術組大鼠血中鈣磷水平明顯下降，血清ALP活性水平上升，說明OVX大鼠處于負鈣平衡，體內(nèi)鈣磷流式增加，吸收降低。本實驗還觀察到，手術模型組反應骨吸收生化指標的ALP活性大大高于假手術組，說明OVX大鼠骨吸收異常增強。皮下注射不同批次待測藥物注射用特立帕肽或陽性對照藥16周后，可明顯抑制血清鈣磷水平的下降，同時部分逆轉(zhuǎn)ALP的升高。

以上結(jié)果表明，注射用特立帕肽皮下注射可以拮抗上述骨質(zhì)疏松發(fā)生的病理過程，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。該研究進一步驗證了固相合成的小分子多肽特立帕肽與國外重組工藝制備的特立帕肽注射液具有一致的體內(nèi)抗骨質(zhì)疏松生物活性。

參考文獻：

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[4] 徐叔云. 藥理實驗方法學[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社. 2006.

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