陶奇昌 陸軍 李強

【摘 要】目的：建立兔椎間盤退行性變動物模型，探討腫瘤壞死因子-α拮抗劑（TNF-α Ra）對存在退行性變的兔椎間盤基質(zhì)代謝的影響。方法：建立兔椎間盤退行性變動物模型，隨機分為試驗組和對照組，每組9只，試驗組從造模2周腹腔注射TNF-α拮抗劑（417 ug/kg），隔4天重復(fù)注射至處死，對照組9只不予任何處理。于造模后1、2、3個月每組分別處死3只大白兔，完整取出腰3/4椎間盤固定、切片，予SABC法進行免疫組化，并使用圖像分析系統(tǒng)對纖維環(huán)中Ⅱ型膠原染色進行灰度值掃描，同理取出腰5/6椎間盤，使用間苯三酚法測量蛋白多糖含量。結(jié)果：術(shù)后第一個月試驗組與對照組椎間盤髓核中Ⅱ型膠原灰度值及蛋白多糖含量無顯著性差異（P>0.05），第二個月及第三個月試驗組與對照組Ⅱ型膠原染色的灰度值及蛋白多糖含量相比有非常顯著性差異（P<0.01）。結(jié)論：TNF-α拮抗劑對存在退行性變的兔椎間盤基質(zhì)代謝有明顯的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】椎間盤；退行性變；免疫組化；間苯三酚；腫瘤壞死因子-α拮抗劑

椎間盤的退行性變是引發(fā)下腰痛的主要原因之一[1]。目前治療方案主要是對于有明顯癥狀、椎間盤退行性變晚期的患者行手術(shù)治療[2] 。TNF-α是重要的炎性細胞因子之一，有研究表明軟骨細胞能產(chǎn)生這種細胞因子，并能促進軟骨細胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2）和膠原酶參與退行性骨關(guān)節(jié)病的發(fā)病[3，4]。本研究使用TNF-α拮抗劑對存在早期退變的兔椎間盤進行干預(yù)，觀察TNF-α拮抗劑對兔腰椎間盤膠原代謝的影響及蛋白多糖的變化，并觀察其組織學(xué)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 健康4月齡雄性新西蘭大白兔18只，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗動物中心提供；注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白（益賽普），購自上海中信國健藥業(yè)有限公司；免疫組化染色試劑盒、兔抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司；SABC試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；間苯三酚購自南京恒生制藥有限公司；日本OLYMPUS光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物模型的建立及分組 椎間盤退變模型的建立參考如下方法[5]：實驗動物術(shù)前12h禁食， 3%戊巴比妥鈉溶液（1mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉，右側(cè)臥位，透視定位腰3/4平面[ 6]，將腹內(nèi)臟器側(cè)移，透視針尖位于椎間隙平面，進行穿刺。穿刺部位消毒包扎，于耳緣靜脈滴注青霉素40×104U。動物蘇醒后放回兔籠，肌注青霉素40×104U，1次/天，連續(xù)注射3天。隨機取9只大白兔做試驗組，隔4天腹腔注射益賽普（417ug/kg體重），分別于術(shù)后1月、2月、3月時各處死3只大白兔，動物處死后立即取出腰椎，立即用蒸餾水沖洗三遍后置入10%中性福爾馬林緩沖液中固定24h，常規(guī)EDTA脫鈣、石蠟包埋，沿椎間盤正中水平面向上下按5μm厚度連續(xù)切片共10張，其中5張玻片留作Ⅱ型膠原免疫組化（髓核），另一側(cè)5張留作其他試驗使用。對照組共9只不予任何處理。試驗過程中標本處理及檢測等各實驗步驟均嚴格保持一致。按上述方法取腰5/6椎間盤置入超低溫冰箱中集中檢測蛋白多糖。

1.2.2 免疫組化法 常規(guī)制備石蠟切片，蒸餾水與30%雙氧水按體積10：1混合，室溫下滴入組織，等待10min。蒸餾水沖洗3次，復(fù)合修復(fù)液修復(fù)10min，水洗3次，滴加5%牛血清白蛋白 室溫封閉20min，滴加濃度為2% 兔抗大鼠Ⅱ型膠原單克隆抗體，4℃過夜。磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG37℃放置20min，滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物試劑置于37℃ 20min，DAB顯色，以肉眼觀察組織顯色，當組織顯色為咖啡色時即自來水沖洗。.以蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。陽性部位都是細

胞外基質(zhì)。每批試驗都隨機抽1張做為陰性對照，即將1抗換成磷酸鹽緩沖液 ，其余步驟同前。切片使用Simple PCI圖象分析軟件對髓核中Ⅱ型膠原的含量進行分析。將灰度值閾值調(diào)成0-255，灰度值越高，則表明膠原的含量越低，測得灰度值作為膠原的相對含量。

1.2.3 蛋白多糖測定 取出椎間盤組織置于離心管中，加入3%NaOH0.5ml置入恒溫振蕩器中振蕩3h，保持溫度在40℃。加入鹽酸約2ml，把溶液pH值調(diào)至8～9，加入100mg/ml胰蛋白酶50μl酶解2h。.將溶液以間苯三酚法[7]測定蛋白多糖的含量，結(jié)果以mg/100mg濕重表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件 SPSS 12.0，所有數(shù)據(jù)均采用 s表示，各組間比較運用t檢驗分析進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化 試驗發(fā)現(xiàn)第一個月試驗組與對照組髓核中Ⅱ型膠原免疫組化染色灰度值相似，隨著試驗時間增加，試驗組較對照組髓核中Ⅱ型膠原免疫組化染色灰度值低，具體各組大白兔Ⅱ型膠原免疫組化染色的灰度值見表1。

2.2 蛋白多糖測定結(jié)果 第一個月時試驗組與對照組蛋白多糖含量相近，無統(tǒng)計學(xué)差異。隨著試驗時間增加，對照組大白兔椎間盤蛋白多糖的含量明顯下降，第二月及第三月時試驗組與對照組相比P<0.01。具體數(shù)據(jù)見表2。

3 討論

椎間盤中的蛋白多糖是由核心蛋白與數(shù)目不等的糖胺多糖（glycosaminog lycan， GAG）鏈通過共價鍵連接而形成的生物大分子。蛋白多糖的代表蛋白聚糖（aggrecan）被進行廣泛深入的研究。蛋白聚糖中的糖胺多糖主要是硫酸軟骨素（CS）、透明質(zhì)酸（HA）和硫酸角質(zhì)素（KS）。GAG含量的改變能可靠的反映PG的變化[8]。在椎間盤退變的早期，蛋白多糖就可出現(xiàn)改變，而且其可以反映椎間盤退變的程度[9]。退變椎間盤中蛋白多糖含量下降同時其性質(zhì)發(fā)生改變，伴隨基質(zhì)中水分的丟失，導(dǎo)致椎間盤基質(zhì)的固定電荷密度和水合狀態(tài)改變，從而引起椎間盤生物力學(xué)的改變，加劇椎間盤退變。

Takahashi N等研究發(fā)現(xiàn)，突出的椎間盤細胞可合成和分泌TNF-α、白介素-1（IL-1）、PGE2等多種炎性介質(zhì)[10]。腫瘤壞死因子可以誘導(dǎo)炎癥因子如IL-1的產(chǎn)生，，而大量試驗表明IL-1可以通過一氧化氮（NO）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）等多種途徑參與降解椎間盤基質(zhì)，從而加速椎間盤退變。注射用重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白是人Ⅱ型腫瘤壞死因子（TNF）受體p75的膜外區(qū)與IgG的Fc段構(gòu)建的融合蛋白，可特異性的阻斷TNF-α與其細胞表面受體的相互作用，從而 抑制IL-1對基質(zhì)中膠原的降解，延緩甚至阻止椎間盤的退變。

國內(nèi)外已有報道將TNF-α拮抗劑應(yīng)用于動物及人體，但將其應(yīng)用于椎間盤退行性變動物模型尚未見報道。本試驗結(jié)果顯示在第一個月試驗組大白兔椎間盤髓核中Ⅱ型膠原染色的灰度值及髓核中蛋白多糖含量無明顯變化，可能原因為干預(yù)過早[5]，椎間盤尚未發(fā)生明顯退變有關(guān)。第二個月及第三個月時試驗組及對照組髓核中Ⅱ型膠原灰度值及蛋白多糖的含量有非常顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示TNF-α拮抗劑能較強的抑制椎間盤膠原及蛋白多糖的降解，對椎間盤的退變有較強的保護作用。

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