盧靜波 周曉輝

【摘 要】目的：探討冬蟲夏草的抗肝纖維化作用機(jī)制。方法：將80例患有慢性肝纖維化的患者分為對(duì)照組和治療組，在常規(guī)護(hù)肝治療基礎(chǔ)上，治療組40 例患者給予冬蟲夏草口服液12周，觀察兩組治療前后肝功能指標(biāo)和肝纖維化指標(biāo)；通過(guò)肝穿刺后免疫印跡技術(shù)檢測(cè)CollagenⅠ、CollagenⅢ和MMP-13的變化。結(jié)果：兩組治療后肝功能均明顯改善；治療組治療后肝纖維化指標(biāo)明顯低于對(duì)照組治療后；兩組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ顯著降低，MMP-13顯著增加，但CCF治療組改善更顯著。結(jié)論：冬蟲夏草通過(guò)降低CollagenⅠ和CollagenⅢ，提高M(jìn)MP-13起到抗肝纖維化的作用。

【關(guān)鍵詞】肝纖維化；冬蟲夏草；膠原；基質(zhì)金屬蛋白酶-13

肝纖維化（Hepatic fibrosis）是機(jī)體對(duì)慢性肝損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，是一種漸進(jìn)的病理過(guò)程，是慢性肝病的共有病理變化。肝纖維化的特征改變是肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ Extracellular matrix， ECM）的過(guò)度增生和異常沉積，嚴(yán)重者的肝纖維化可導(dǎo)致肝硬化，甚至引起肝功能衰竭[1]。目前從肝纖維化發(fā)生發(fā)展的不同環(huán)節(jié)入手研制了許多抗纖維化藥物，但仍未有十分確定。因此，尋找理想的抗肝纖維化藥物及有關(guān)肝纖維化發(fā)病機(jī)制的闡明，具有重要的理論和臨床意義。

冬蟲夏草（Chinese Caterpillar Fungus，CCF）是從是麥角菌科真菌冬蟲夏草寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體，研究顯示冬蟲夏草有防止肝纖維化的作用[2]，但其作用機(jī)制未完全明確。本研究從通過(guò)臨床試驗(yàn)探討冬蟲夏草抗肝纖維化的作用機(jī)理，為冬蟲夏草的臨床防治肝纖維化提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1病例資料及分組

選擇2010年1月至2012年2月在本院住院的患有慢性肝纖維化的患者80例，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。對(duì)照組40例，男性32例，女性8例，平均年齡（41.3±6.7）（35-46）歲；治療組40例，男性33例，女性7例，平均年齡（39.8±5.8）（36-43）歲。兩組病例在年齡分布、性別分布和治療前肝功能檢測(cè)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2治療方法

兩組患者均給予常規(guī)護(hù)肝治療及支持治療等治療。治療組在一般治療的基礎(chǔ)上口服冬蟲夏草口服液25ml，每天1次，療程12周，治療期間均不加用其它抗肝纖維化的藥物。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1 血清學(xué)檢查

對(duì)照組和治療組所有患者抽取靜脈血3ml，經(jīng)離心機(jī)離心后分離血清，送化驗(yàn)室檢測(cè)。

1）檢測(cè)肝功能指標(biāo)

利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白蛋白（ALb）和總膽紅素（TBiL）的變化。

2）檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)

利用放免分析法檢測(cè)透明質(zhì)酸（HA）、層黏蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原肽（PC-Ⅲ）和Ⅳ型膠原（CⅣ）的變化。

1.3.2 肝穿刺后Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）和Ⅲ型膠原（CollagenⅢ）檢測(cè)

對(duì)照組和治療組各8名患者經(jīng)局部麻醉，在CT的定位和引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺，獲取肝臟標(biāo)本約20毫克。將肝組織入4℃裂解液勻漿15 min，4℃離心，取上清，Bradford法測(cè)定肝組織蛋白濃度。肝組織蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉2 h，1：300稀釋的CollagenⅠ抗體、CollagenⅢ抗體和MMP-13抗體4℃過(guò)夜，二抗（1：3000稀釋）與硝酸纖維素膜雜交。將膜置于ECL中1min，曝光，顯影，定影。采用IPP6.0圖像分析軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果以目的蛋白與β-actin的累積光密度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以x? ± s 表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肝功能指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示對(duì)照組與治療組治療后血清ALT、AST和TBiL水平與治療前相比均顯著降低，血清ALb水平與治療前相比顯著增加，表現(xiàn)為對(duì)照組治療后ALT、AST和TbiL比治療前分別降低69.3%（P<0.01）、67.9%（P<0.01）和62.3%（P<0.01），ALb比治療前增加31.0%（P<0.05）；治療組治療后ALT、AST和TbiL比治療前分別降低71.8%（P<0.01）、71.8%（P<0.01）和63.4%（P<0.01），ALb比治療前增加20.5%（P<0.05）；但兩組治療后ALT、AST、TBiL和Alb水平相比較無(wú)明顯差別（P>0.05）（Table1）。

2.2肝纖維化指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示對(duì)照組治療后血清HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平較治療前無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平與治療前相比均顯著降低表現(xiàn)為治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平比治療前分別降低39.9%（P<0.01）、43.1%（P<0.01）、38.5%（P<0.01）和25.4%（P<0.01）。治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平明顯低于對(duì)照組治療后，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Table2）。

2.3. 免疫印跡法測(cè)CollagenⅠ、CollagenⅢ和MMP-13變化

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示對(duì)照組與治療組治療后肝組織CollagenⅠ和CollagenⅢ水平與治療前相比均顯著降低，肝組織MMP-13水平與治療前相比顯著增加，表現(xiàn)為對(duì)照組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ水平比治療前分別降低22.5%（P<0.05）和17.0%（P<0.05），MMP-13比治療前增加21.9%（P<0.05）；治療組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ水平比治療前分別降低39.8%（P<0.01）和40.1%（P<0.01），MMP-13比治療前增加37.8%（P<0.05）。治療組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ水平明顯低于對(duì)照組治療后，MMP-13水平明顯高于對(duì)照組治療后，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Table3）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和治療組治療后ALT、AST和TBiL水平降低，ALb水平顯著增加，提示兩種治療方法均有效的改善了肝功能。肝纖維化指標(biāo)顯示冬蟲夏草治療組治療后HA、LN、PC-Ⅲ和CⅣ水平與對(duì)照組治療后相比均顯著降低，而對(duì)照組治療后沒(méi)有顯著改變，暗示冬蟲夏草具有改善肝纖維化的功能，對(duì)肝細(xì)胞具有保護(hù)作用。免疫印跡結(jié)果顯示兩種治療方法均降低CollagenⅠ和CollagenⅢ，提高了MMP-13水平，而冬蟲夏草治療組治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ水平低于對(duì)照組治療后，MMP-13水平高于對(duì)照組治療后，提示冬蟲夏草改善肝纖維化的機(jī)制可能通過(guò)降低CollagenⅠ和CollagenⅢ，提高M(jìn)MP-13起到對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用。

研究顯示，肝星狀細(xì)胞（Hepatic stellate cell， HSC）的激活認(rèn)為是肝纖維化過(guò)程中最重要的一步[3]。HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，通過(guò)增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成[4]，因此各種致纖維化因素均把肝星狀細(xì)胞作為最終靶細(xì)胞。冬蟲夏草有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。有研究報(bào)道，PDGF對(duì)HSC增殖有顯著促進(jìn)作用，蟲草菌絲可顯著抑制纖維化肝臟PDGF的表達(dá)[5]。但其具體機(jī)制尚不清楚。本課題從另一個(gè)角度分析，冬蟲夏草可以通過(guò)降低CollagenⅠ和CollagenⅢ，提高M(jìn)MP-13，起到抑制肝纖維化的作用。

細(xì)胞外基質(zhì)包括膠原、糖蛋白及蛋白多糖等，其中膠原是最主要的成分，在肝臟中有Ⅰ型，Ⅲ型-Ⅵ型共5型，而以Ⅰ型和Ⅲ型為主。肝臟調(diào)控膠原代謝的關(guān)鍵酶是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），其中MMP13是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中對(duì)肝臟膠原降解作用較強(qiáng)的酶[6]。本研究中通過(guò)免疫印跡觀察到的冬蟲夏草治療后CollagenⅠ和CollagenⅢ的降低，MMP-13的增高效果明顯高于一般治療，證實(shí)冬蟲夏草抑制了肝星狀細(xì)胞的激活，降低了CollagenⅠ和CollagenⅢ的合成，提高了MMP-13的表達(dá)，緩解了肝纖維化過(guò)程。

因此，本研究通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草口服液作為一種中藥制劑能夠抑制肝星狀細(xì)胞的激活，降低了CollagenⅠ和CollagenⅢ的合成，提高了MMP-13的表達(dá)，緩解肝纖維化過(guò)程，為冬蟲夏草臨床防治肝纖維化提供了新的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Fallowfield J， Hayes P. Pathogenesis and treatment of hepatic fibrosis： is cirrhosis reversible[J]？ Clin Med， 2011， 11（2）：179-183.

[2] 王要軍， 孫自勤， 權(quán)啟鎮(zhèn)， 等. 冬蟲夏草治療肝纖維化的臨床療效 [J]. 前衛(wèi)醫(yī)藥雜志， 1996， 13（2）： 70-71.

[3] Reeves HL， Friedman SL. Activation of hepatic stellate cells-a key issue in liver fibrosis [J]. Front Biosci. 2002， 7： d808-826.

[4] Dennler S， Huet S， Gauthier JM. A short aminoacid sequence in MH1 domain is responsible for functional differences between Smad2 and Smad3 [J]. Oncogene， 1999， 18： 1643-1648.

[5] 遲晶， 付寶玉，李玉玲. 細(xì)胞因子與肝纖維化 [J]. 日本醫(yī)學(xué)介紹， 1997， 18（8）： 377-378.

[6] 孫嫵弋， 桂雙英， 吳麗， 王華， 魏偉. 芍芪多苷對(duì)肝纖維化大鼠肝臟星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶13及組織金屬蛋白酶抑制因子1表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2010， 35（11）： 1447-1451.