李艷麗

【摘 要】目的：研究羅格列酮對人宮頸癌Hela細胞凋亡的影響及其機制。方法：MTT法檢測RGZ處理Hela細胞后的增殖活性并繪制生長抑制曲線。流式細胞儀檢測Hela細胞凋亡率，Wstern檢測Hela細胞Survivin和Livin蛋白表達的變化。結果：RGZ能呈劑量依賴性和時間依賴性的抑制Hela的增殖（P<0.01）。流式細胞儀檢測發(fā)現以RGZ處理Hela細胞后細胞凋亡率呈劑量依賴性上升 （P<0.01）。Western檢測發(fā)現Hela細胞Survivin和Livin蛋白表達顯著下降 （P<0.01）。結論：RGZ能抑制宮頸癌Hela細胞增殖和并誘導凋亡，其作用機制與下調Survivin和Livin蛋白表達有關。

【關健詞】宮頸癌；增殖；凋亡

宮頸癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的第二位，嚴重威脅著婦女的生命和健康。雖然發(fā)達國家已經成功地降低了宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。但在很多發(fā)展中國家，宮頸癌仍然是這些地區(qū)主要的惡性腫瘤之一，資料顯示，每年有超過50萬的宮頸癌新發(fā)病例，其中90%來自發(fā)展中國家[1]。目前雖然宮頸癌的治療取得了較好的臨床效果，但預后仍有較多不盡人意之處。因此，尋找行之有效的化療藥物具有十分重大的意義。羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）為臨床常用的糖尿病治療藥物，近年來研究發(fā)現它能抑制乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤細胞的增殖，但尚未見其對人宮頸癌細胞系作用的報道。本文旨在研究RGZ對人宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響，并探討其抗腫瘤活性的機制，為其臨床應用提供參考依據。

1材料和方法

1.1材料

人宮頸癌Hela細胞株購自購于中科院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基和新生牛血清購自美國Invitrogen公司。羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）購自葛蘭素史克公司公司。UA和碘化丙啶 （propidium iodide，PI）染料和噻唑藍（MTT）及二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）試劑購自Sigma公司。Survivin和Livin及β-actin抗體均購自Santa Cruz。辣根過氧化酶標記物山羊抗小鼠IgG（二抗）和堿性磷酸酶顯色試劑盒購于北京中山生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和藥物處理

Hela細胞接種于含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素）中，37℃，5%CO2，飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測RGZ對Hela細胞生長的抑制作用

取對數生長期的Hela細胞按200μl/孔細胞懸液（1×105個細胞/ml）接種于96孔板。加入RGZ終濃度為12.5、25、50、100μmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基，同時設陰性對照和空白對照，每組均設3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。培養(yǎng)結束前4h每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl。終止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入DMSO 150μl震蕩10分鐘，酶聯(lián)免疫檢測儀上于570nm波長檢測各孔吸光度值（A值）。細胞生長抑制率=（對照組A值-給藥組A值） /對照組A值×100%。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞

收集12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后的Hela細胞，輕輕吹打制備單細胞懸液細胞。細胞懸液移入離心管，4℃，500×g，離心5min。棄上清液，冰預冷PBS洗細胞2次。上流式細胞儀雙染檢測凋亡計算細胞凋亡率。

1.2.4 Western蛋白印跡法檢測RGZ對Hela細胞Survivin和Livin蛋白表達表達的影響

收集12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后的Hela細胞，提取細胞總蛋白。SDS-PAGE 凝膠電泳后轉移至PVDF膜上。加一抗抗體靜置過夜，TBST漂洗，加入二抗孵育后熒光顯色，沖洗。

1.3統(tǒng)計學分析

數據應用SAS 6.12和SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理，檢驗水準為α=0.05。

2結果

2.1 RGZ對Hela細胞增殖的影響

RGZ具有顯著抑制人宮頸癌Hela細胞增殖的作用，呈現明顯的濃度依賴性和時間依賴性；不同濃度組間、不同時間組間生長抑制率均有顯著性差異（F=28.205，P<0.01）（圖1）。

圖 1 RGZ抑制細胞生長的時效和量效關系

2.2 RGZ對Hela細胞凋亡率的影響

空白對照組的Hela細胞的凋亡率較低，經12.5、25、50、100μmol/L RGZ作用24h后，細胞凋亡率分別為5.3±2.96、11.85±3.72、16.05±3.91、24.83±4.46。與對照組1.22±0.94相比，不同濃度組間細胞凋亡率有顯著性差異（F=11.322，P<0.01）（圖2）。

圖2 不同濃度RGZ作用后Hela細胞凋亡率分析

2.3 RGZ對Hela細胞Survivin和Livin蛋白表達表達的影響

經12.5、25、50、100μmol/L RGZ RGZ作用24h后Hela細胞Survivin蛋白表達明顯降低，分別降低至0.84±0.09、0.67±0.07、0.49±0.12、0.28±0.14，與對照組的0.95±0.13比較，不同濃度組間有顯著性差異（F=10.201，P<0.01）；Hela細胞Livin蛋白表達明顯降低，分別降低至0.76±0.13、0.63±0.1、0.49±0.11、0.34±0.14，與對照組的0.81±0.11比較，不同時間組間有顯著性差異（F=16.135，P<0.01）。

圖3 不同濃度RGZ作用后Hela細胞Survivin和Livin蛋白的表達

3討論

近年來研究發(fā)現過氧化物酶體增殖物激活受體γ （PPARγ）的特異性配體能夠誘導多種腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖，其中在肺癌和前列腺癌患者的臨床治療中，PPARγ配體已表現出了良好的抑瘤效果[2]。羅格列酮屬噻唑烷二酮類藥物（thiazolidinediones，TZDs）是PPARγ激動劑，對PPARγ親和力大，特異性強，且毒副作用輕，近年研究顯示，羅格列酮能誘導多種腫瘤細胞的終末分化，其機制可能是阻滯腫瘤細胞周期、抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的侵襲及血管生成等[3-4]。目前尚未見其對人宮頸癌細胞系作用的報道。本文旨在研究RGZ對人宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響，并探討其抗腫瘤活性的機制，為其臨床應用提供參考依據。本研究證實RGZ對人宮頸癌Hela細胞有顯著的增殖抑制作用并呈濃度和時間依賴性。本實驗還觀察了RGZ對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響：流式細胞儀可發(fā)現RGZ作用后宮頸癌Hela細胞的凋亡率高于對照組，成時間依賴性上升，表明RGZ可有效地誘導宮頸癌Hela細胞的凋亡。

本研究結果認為RGZ能夠抑制人宮頸癌Hela細胞的生長，并能誘導腫瘤細胞的凋亡。作為重要的免疫營養(yǎng)物質，RGZ在腫瘤研究中有著重要的作用，但其作用途徑和機制，尚需進一步研究。

參考文獻：

[1] Holley JL. Screening， diagnosis， and treatment of cancer in long-term dialysis patients[J]. Clin J Am Soc Nephrol， 2007， 2（3）：604-10.

[2] Espadinha C， Pinto AE， Leite V. Underexpression of PPARgamma is associated with aneuploidy and lower differentiation of thyroid tumours of follicular origin[J]. Oncol Rep， 2009， 22（4）：907-13.

[3] Yang SJ， Choi JM， Chae SW， et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma by rosiglitazone increases sirt6 expression and ameliorates hepatic steatosis in rats[J]. PLoS One， 2011， 6（2）：e17057.

[4] Kim SL， Kim EM， Cheong SJ， et al. The effect of PPAR-gamma agonist on （18）F-FDG uptake in tumor and macrophages and tumor cells[J]. Nucl Med Biol， 2009， 36（4）：427-33.