牛延菲等

摘要：目的：建立用高效液相色譜法測(cè)定痛舒片中野黃芩苷含量的方法。方法：用waters XTerra C18柱（5μm，4.6×250 mm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-四氫呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）；檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm；柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。結(jié)果：對(duì)照品線性范圍為0.1316μg～2.632μg，相關(guān)系數(shù)0.9997，平均回收率為100.64%，RSD=1.22%（n=9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便可行，重復(fù)性好，能有效控制痛舒片的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：痛舒片；野黃芩苷；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-2349（2013）07-0051-03

痛舒片由云南省藥物研究所制藥廠生產(chǎn)，由七葉蓮、三七、燈盞細(xì)辛、玉葡萄根等組成，對(duì)治療跌打損傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、肩周炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)痛、乳腺小葉增生等疾病有顯著療效。燈盞細(xì)辛作為其處方中藥味之一，具有活血通絡(luò)止痛，祛風(fēng)散寒之功效，用于中風(fēng)偏癱，胸痹心痛，風(fēng)濕痹痛[1]。野黃芩苷為燈盞細(xì)辛的有效成分，具有降低腦血管阻力，改善腦血循環(huán)、增加腦血流量及抗血小板凝集的作用。同時(shí)，野黃芩苷也是中國(guó)藥典規(guī)定的燈盞細(xì)辛藥材中的主要檢驗(yàn)指標(biāo)。在痛舒片藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)野黃芩苷的含量進(jìn)行控制，本文以燈盞細(xì)辛的有效成分野黃芩苷為對(duì)照，對(duì)HPLC測(cè)定痛舒片中野黃芩苷含量的方法進(jìn)行研究，確定了易控的高效液相色譜方法。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試藥美國(guó)Agilent1100高效液相色譜儀：包含四元泵、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、在線真空脫氣機(jī)、智能化柱溫箱及HP化學(xué)工作站；SK3200LH超聲波處理器；痛舒片（批號(hào)：100831、100929、110211、110315、110627、110719、110808、110826、110923、111012），由云南省藥物研究所制藥廠提供；野黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110842-200403），供含量測(cè)定用（純度97.12℅），由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；所用流動(dòng)相甲醇、四氫呋喃為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水，處理樣品的甲醇為分析純。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1色譜條件色譜柱：Waters XTerra C18柱（5 μm，4.6×250 mm）；流動(dòng)相：甲醇-四氫呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫為30℃。理論塔板按野黃芩苷計(jì)算不低于4000，在該色譜條件下，供試品、對(duì)照品分離較好，與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離。

1.2.2溶液的制備取野黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取本品20片，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲處理（功率135 W，頻率40HZ）30 min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。依處方比例制備缺燈盞細(xì)辛的陰性對(duì)照品，按上述供試品溶液處理方法制備陰性供試品溶液。

1.2.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)按供試品溶液制備方法制備供試品溶液和缺燈盞細(xì)辛的陰性供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣對(duì)照品、供試品、陰性樣品各5 μL，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖譜可以看出供試品溶液色譜中與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰出現(xiàn)，而陰性樣品無(wú)此峰出現(xiàn)，表明處方中其他成分對(duì)成品中野黃芩苷的含量測(cè)定無(wú)干擾。

1.2.4線性關(guān)系考察精密稱(chēng)取野黃芩苷對(duì)照品（純度97.12℅）27.10 mg置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制得對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.5264 mg/mL）。精密吸取此溶液并加甲醇稀釋成0.02632、0.05264、0.07896、0.15792、0.21056、0.2632、0.5264 mg/mL的對(duì)照品溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣5μl測(cè)定。以對(duì)照品溶液含量（μg）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=1313.7x-24.861，相關(guān)系數(shù)r=0.9997。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，野黃芩苷在0.1316 μg～2.632 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.5加樣回收率試驗(yàn)精密稱(chēng)取9份供試品（批號(hào)：110826，已測(cè)含量為0.175℅，每份約0.6 g，對(duì)照品濃度0.1056 mg/mL），分別加濃度為0.1056 mg/mL對(duì)照品8、8、8、10、10、10、12、12、12 mL，然后按供試品溶液處理方法同法處理，將處理好的供試品溶液按含量測(cè)定方法同法測(cè)定，計(jì)算：平均回收率=100.64，RSD=1.22℅（n=9）。結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)取供試品6份，按供試品制備方法處理，測(cè)定野黃芩苷含量，結(jié)果RSD=1.2%（n=6），表明本法具有良好的重復(fù)性。

1.2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液5 μL，按測(cè)定方法分別于0、1、2、6、9、12、24h進(jìn)樣，測(cè)定野黃芩苷的峰面積，RSD=0.77%（n=7），結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.9樣品測(cè)定取10批樣品按含量測(cè)定方法測(cè)定野黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2討論

2.1樣品前處理方法的選擇

2.1.1提取溶劑、溶劑體積及提取方法的選擇根據(jù)野黃芩苷的理化性質(zhì)，文獻(xiàn)[2～4]多采用甲醇或70%甲醇作為提取溶媒，經(jīng)試驗(yàn)，結(jié)果表明甲醇提取野黃芩苷效果好，且峰型較好。故確定以甲醇作為提取溶劑。同時(shí)比較了定容至10 mL，25 mL，與定容至50 mL 3種不同溶劑體積對(duì)提取的影響，結(jié)果表明25 mL的溶劑已經(jīng)可以完全提取出樣品中的野黃芩苷，為節(jié)省溶劑，確定以25 mL為提取溶劑體積。同時(shí)比較了超聲，回流二種方法，結(jié)果表明都能將野黃芩苷較完全的提取出來(lái)，但回流提取方法操作較繁瑣，超聲提取法對(duì)儀器要求簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，提取時(shí)間短，無(wú)需加熱。故在本試驗(yàn)中，選擇了超聲法來(lái)提取野黃芩苷。

2.1.2提取時(shí)間的選擇取本品（批號(hào)110826）1.0 g，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中，加甲醇20 mL，分別按20、30、40 min 3個(gè)不同時(shí)間進(jìn)行超聲處理，放冷，加甲醇定容至刻度。搖勻，用0.45 μm濾膜濾過(guò)，即得。分別取上述供試液5 μL進(jìn)樣，進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明超聲30 min已提取較為完全，所以確定提取時(shí)間為30 min。

2.2流動(dòng)相的選擇通過(guò)查閱文獻(xiàn)，比較了以下幾種不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)：（1）甲醇-0.1%磷酸溶液（40：60）；（2）甲醇-四氫呋喃-0.2%磷酸溶液（13：13：74）；（3）甲醇-四氫呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）。試驗(yàn)結(jié)果表明，方法（1）分離色譜峰效果差，方法（2）峰的對(duì)稱(chēng)性較差，方法（3）所得峰形佳，基線平穩(wěn)，野黃芩苷峰與其它峰達(dá)到很好的分離，故選擇甲醇-四氫呋喃-0.1%磷酸溶液（14：14：72）作為流動(dòng)相。

參考文獻(xiàn)：

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（收稿日期：2013-05-02）