吳振宇　吳廣均　姜泉等

【摘 要】目的：探討輻射刺激、心理應(yīng)激加酒精刺激及抗原免疫刺激3種不同因素對(duì)膠原蛋白的代謝失調(diào)及組織器官的損壞。方法：輻射刺激采用γ射線照射，心理應(yīng)激加酒精刺激采用小站臺(tái)水環(huán)境應(yīng)激加質(zhì)量濃度42%白酒灌胃刺激，抗原免疫刺激采用II型膠原免疫。膠原蛋白采用苦味酸-天狼星紅染色，偏振光顯微鏡下觀察；Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)膠原變化狀況。結(jié)果：輻射損傷后膠原在血管周圍的面積明顯較非刺激組增多，輻射后4周較2周更嚴(yán)重；心理應(yīng)激加質(zhì)量濃度42%白酒灌胃后，心、肝、腎的血管周圍均出現(xiàn)膠原沉聚面積加大，且向周圍組織滲透；II型膠原免疫后關(guān)節(jié)腔膠原的沉聚面積較非刺激組更為嚴(yán)重，導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直。結(jié)論：物理、化學(xué)、心理及生物因素都會(huì)不同程度影響膠原蛋白的代謝與失衡，這些膠原蛋白沉聚在血管周圍導(dǎo)致硬化，反應(yīng)的面積大小次序?yàn)樾?腎>肺>肝。沉聚在關(guān)節(jié)周圍導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直或活動(dòng)受限。

【關(guān)鍵詞】 膠原蛋白；輻射損傷；心理應(yīng)激；酒精肝損傷；小鼠；實(shí)驗(yàn)研究

膠原蛋白是生物體內(nèi)一種重要的蛋白質(zhì)，也是結(jié)締組織的主要蛋白成分，由于其優(yōu)良的理化性質(zhì)和生理活性功能，已引起人們的廣泛關(guān)注。水解動(dòng)物蛋白又稱酶解膠原蛋白，是一種生物性高分子物質(zhì)，其含有的18種氨基酸中有7種是人體必需的，還含有人體所必需的部分金屬微量元素，蛋白營養(yǎng)價(jià)值高、性能優(yōu)越，是良好的天然生理活性物質(zhì)，易被人體吸收利用，故能促進(jìn)細(xì)胞生長，改善人體多種功能，免疫調(diào)節(jié)作用明顯。骨膠原多肽具有抗高血壓、抗氧化和衰老、預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松、治療胃潰瘍等疾病和促進(jìn)皮膚膠原代謝、促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等生理功能[1-3]。

但是事物都有其兩面性，在自然界和日常生活中，可怕的物理、化學(xué)、心理和生物的致病因素會(huì)給膠原帶來不同的“新生”，膠原的作用可謂喜憂參半。輻射損傷、心理應(yīng)激及酒精肝損傷及免疫性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)提示，膠原參與了疾病的發(fā)生發(fā)展過程，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7～8周齡昆明小鼠（購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)0205315）70只，雌性，體質(zhì)量20～22 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 天青石藍(lán)、飽和苦味酸天狼星紅（Sigma公司生產(chǎn)）、質(zhì)量濃度42%白酒。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 60Coγ照射機(jī)（北京雙原儀器有限公司生產(chǎn)）；有機(jī)塑料盒；電刺激條件反射箱及水站臺(tái)實(shí)驗(yàn)設(shè)備（自制）；均質(zhì)儀（Ika）、日本生產(chǎn)的OLYMPUS IX-70倒置熒光顯微鏡及Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組 ①按物理因素刺激分為未照射組、照射組；②按心理及酒精因素刺激分為未應(yīng)激組、心理應(yīng)激組、心理應(yīng)激+酒精刺激組。③按生物因素刺激分為未刺激組、膠原免疫刺激組。按以上3種因素將實(shí)驗(yàn)用小鼠共分為7組，每組10只。正常飼養(yǎng)。

2.2 物理因素刺激（放射照射刺激） 照射動(dòng)物采用60Coγ射線進(jìn)行全肺單次照射24Gy。2周和4周取肺病理切片。

2.3 心理及酒精因素刺激（應(yīng)激+酒精刺激） 電刺激條件反射箱，實(shí)驗(yàn)時(shí)通電，放入小鼠，電擊其足底部；每日定時(shí)電擊1次，每次20 min。電擊后，水環(huán)境站臺(tái)18 h，即7：00-23：00，中間每隔3 h給予食物灌胃1次，每天22：00給予酒精誘導(dǎo)，持續(xù)10 d。取心、肝、腎病理切片。

2.4 生物因素刺激（II型膠原免疫刺激） 取0.05 mL

乙酸加入Ⅱ型膠原凍干粉中，使其混合均勻，將完全佐劑置入試管中，開啟均質(zhì)儀慢慢加入等量Ⅱ型膠原，乳化至油包水狀。在每只小鼠尾根注射Ⅱ型膠原和完全佐劑乳化后的混合液0.1 mL，1周后以相同劑量予每只大鼠尾部加強(qiáng)注射1次，取關(guān)節(jié)病理切片。

2.5 苦味酸-天狼星紅染色 組織病理切片用質(zhì)量濃度0.1%飽和苦味酸天狼星紅溶液染色60 min，

自來水洗5 min。May-蘇木素染液復(fù)染細(xì)胞核1 min，

自來水洗10 min，梯度酒精脫水各1 min，二甲苯透明各15 min，中性樹膠封片。偏振光顯微鏡下觀察肺泡間隔及肺間質(zhì)面內(nèi)膠原的沉聚分布。

用日本產(chǎn)OLYMPUS IX-70倒置熒光顯微鏡及Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)，在偏光顯微鏡下分別測(cè)定膠原在血管周圍的面積變化。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，組間差異采用方差分析及t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 2 400cGy 60Coγ射線對(duì)小鼠肺小血管膠原的影響 當(dāng)多次輻射損傷后，膠原的代謝失衡，肺血管周圍明顯增多，面積加大，4周后有膠原向肺組織滲透，這是放射損傷的前期血管變化之一，最終導(dǎo)致肺纖維化，見表1、圖1。

3.2 心理應(yīng)激及酒精刺激對(duì)小鼠心、肝、腎血管的影響 心理應(yīng)激及心理應(yīng)激加酒精刺激后，心、肝、腎血管均出現(xiàn)膠原的增多，特別是向血管周圍的擴(kuò)展及膠原種類的增多，是導(dǎo)致這些組織和器官硬化的主要因素，見表2、圖2-4。

3.3 Ⅱ型膠原和完全佐劑對(duì)小鼠關(guān)節(jié)膠原的影響 免疫刺激后的關(guān)節(jié)變化表明，膠原大量產(chǎn)生和代謝失衡，大量的膠原沉聚在關(guān)節(jié)腔，導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直和結(jié)構(gòu)破壞，見圖5。

4 討 論

膠原蛋白是機(jī)體內(nèi)含量最多的蛋白質(zhì)，約占到人體總質(zhì)量的6%。它們存在于細(xì)胞與細(xì)胞之間，扮演著連接組織的角色[1]。膠原蛋白分布在全身各個(gè)組織器官之中，如骨骼、軟骨、韌帶、各種內(nèi)膜、筋膜及相關(guān)組織等， 為機(jī)體維持各個(gè)器官的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和張力。膠原蛋白是一類特殊的蛋白質(zhì)，一般的蛋白質(zhì)是雙螺旋結(jié)構(gòu)，而膠原是一種三螺旋結(jié)構(gòu)的特殊硬蛋白。過去認(rèn)為膠原是無生理活性的蛋白質(zhì)，隨著對(duì)其深入研究后發(fā)現(xiàn)，膠原與組織的形成、成熟，細(xì)胞間信息的傳遞，細(xì)胞的增生、分化、運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞免疫，腫瘤轉(zhuǎn)移以及關(guān)節(jié)潤滑，傷口愈合、鈣化作用，血液凝固和衰老等有著密切的關(guān)系；也與許多結(jié)締組織膠原病的發(fā)生密切相關(guān)。

4.1 膠原蛋白與血管 器官纖維化是導(dǎo)致器官衰竭的常見原因之一，在發(fā)達(dá)國家，大約有45%的患者死亡與慢性纖維增生性疾病有關(guān)。在我國，肺纖維化的發(fā)病率近年有上升趨勢(shì)。肺纖維化與肺泡毛細(xì)血管基底膜受損、上皮內(nèi)皮細(xì)胞再生障礙及肺組織的異常修復(fù)有關(guān)，它以過度的細(xì)胞外基質(zhì)沉聚和抗凋亡的肌成纖維細(xì)胞聚集為特征。細(xì)胞外基質(zhì)過度沉聚是肺纖維化的重要特征，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白是肺纖維化細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要成分，它們?cè)诜谓M織中的含量反映了肺纖維化的嚴(yán)重程度。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類最重要的降解ECM的蛋白酶家族，并且MMPs中的某些成員是至今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能分解纖維性膠原的蛋白酶，如Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白即主要由MMP-1分解代謝，其作用受金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPS）如TIMP1的調(diào)節(jié)，兩者均為TGF-β/Smads的下游細(xì)胞因子。

目前已確認(rèn)的膠原蛋白有近30種之多，以I、Ⅱ及Ⅲ型最為常見，其中I型膠原占全部膠原蛋白的90%以上，是生物體各種結(jié)締組織（腦膜、筋膜、韌帶等）的主要組成分。圖1～5顯示，物理、化學(xué)、生物及心理的因素均可以導(dǎo)致血管周圍膠原代謝的異常，所以，如何避免物理、化學(xué)、生物等不利因素及調(diào)整心理應(yīng)激因素是防治疾病的關(guān)鍵，50%以上疾病的發(fā)生和發(fā)展都與膠原的合成-分解異常相關(guān)，如何保持膠原代謝的平衡是研究者的重要課題。

4.2 膠原蛋白與骨 膠原約占人骨中有機(jī)成分的90%～95%，主要是以I型膠原為主。近期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面的特異性受體α整合素亞單位緊密結(jié)合后，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖、分化。研究發(fā)現(xiàn)，I型膠原可提高成骨細(xì)胞的成骨能力，刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和胞外基質(zhì)組成。正常關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)內(nèi)的主要膠原成分是Ⅱ型膠原，占總膠原量的90%～95%。軟骨細(xì)胞會(huì)把合成的大量II型膠原、蛋白多糖（PG）等物質(zhì)分泌到ECM中，構(gòu)成細(xì)胞外纖維網(wǎng)架，給細(xì)胞提供支持與保護(hù)。Ⅱ型膠原同化異化平衡的改變及蛋白多糖的流失是關(guān)節(jié)軟骨喪失其正常生物力學(xué)特性的直接原因，其變化與骨關(guān)節(jié)炎（OA）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的滑膜病變有著密切關(guān)系。

圖5可見，膠原的代謝差異較大，后者關(guān)節(jié)腔已經(jīng)充滿膠原蛋白，這是AS的重要病理因素今后的研究重點(diǎn)應(yīng)該圍繞如何使膠原在OA、RA、強(qiáng)直性脊柱炎（AS）等關(guān)節(jié)炎中平衡，分析這類疾病發(fā)生和發(fā)展的重點(diǎn)因素，找到防治的節(jié)點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)中提示，刺激后膠原的反應(yīng)面積大小次序?yàn)樾难?腎血管>肺血管>肝血管，這與疾病的發(fā)生和發(fā)展程度相似。藥物治療可以適當(dāng)平衡膠原的代謝，增減膠原蛋白是一個(gè)非常關(guān)鍵的問題。

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