胡霞 谷希樹 劉曉琳等

摘要：小菜蛾（Plutella xylostella L）是一種危害十字花科植物的世界性害蟲，研究其基因功能為尋找新的小菜蛾防治方法具有重要意義。本研究克隆了小菜蛾p38 MAPK基因的開放閱讀框（ORF），并根據(jù)其DNA序列推導(dǎo)出了蛋白一級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個含有349個氨基酸殘基的蛋白。通過SMART網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在第20～304位氨基酸殘基區(qū)域存在著一個典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，說明它是一個潛在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。Blast比對發(fā)現(xiàn)Pxp38基因與家蠶Bmp38基因、釀酒酵母ScHOG1基因、人類Homo sapiens p38 基因在蛋白一級結(jié)構(gòu)上的相似性分別是917%、516%和786%，說明p38 MAPK基因在進化上具有較高的保守性。

關(guān)鍵詞：小菜蛾；p38基因；MAPK；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：Q785：Q969.42+5.2 文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2013）08-0015-04

小菜蛾（Plutella xylostella L）屬鱗翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutellidae），其分布范圍廣，繁殖能力強，主要取食十字花科植物，嚴(yán)重危害蔬菜生產(chǎn)_[1，2]。由于小菜蛾的抗藥性發(fā)展十分迅速，因此，尋找新的防治方法已經(jīng)變得十分迫切_[3，4]。為了更好地實現(xiàn)小菜蛾的防治，需要更多地了解小菜蛾的基因尤其是耐藥基因及響應(yīng)外界刺激相關(guān)基因的生物學(xué)功能_[5～7]。2012年福建農(nóng)林大學(xué)的尤民生教授等_[7]領(lǐng)導(dǎo)的國際合作小組第一次完成了小菜蛾的全基因組序列圖譜的繪制，這為小菜蛾基因功能的研究以及發(fā)展新的防治手段揭開了新的篇章，具有重要意義。本研究就是在小菜蛾全基因組測序的基礎(chǔ)上完成的。

蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)功能經(jīng)常需要磷酸化和去磷酸化修飾，細(xì)胞中具有磷酸化修飾功能的酶是蛋白激酶_[8]。MAPK（Mitogen-activated protein kinase）是一類典型的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，在真菌、植物和動物等各種真核生物細(xì)胞內(nèi)保守存在。它可以通過三層蛋白激酶級聯(lián)系統(tǒng)，響應(yīng)外界環(huán)境各種脅迫刺激，起始細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)途徑，具有重要的生物學(xué)功能_[9，10]。人類細(xì)胞中的MAPK包括p38、Erk1、Erk2和JNK等_[11，12]。

本研究克隆了小菜蛾的Pxp38基因，根據(jù)其基因序列推導(dǎo)出蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，分析預(yù)測了該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，并研究了該基因與家蠶Bmp38基因、釀酒酵母ScHOG1基因、人類Homo sapiens p38 基因之間的同源性，為下一步深入研究Pxp38基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法11供試?yán)ハx

本實驗所用小菜蛾為天津市植物保護研究所室內(nèi)飼養(yǎng)的敏感種群，用無蟲甘藍(lán)苗繼代飼養(yǎng)20代以上，取四齡幼蟲供試。

1.2主要試劑

Trizol和SuperScript cDNA合成試劑盒購自Invitrogen公司；Taq酶、dNTPs、pMD18-T載體和Ecoli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ購自NEB公司；DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖、蛋白胨、氨芐青霉素、X-gal、IPTG、DEPC和質(zhì)粒小提試劑盒等購自北京天根生化科技公司。

1.3引物設(shè)計

根據(jù)小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫DBM-DB（Diamondback moth Genome Database）_[7]提供的Px015291基因序列，在其開放閱讀框（ORF）兩側(cè)各設(shè)計一條引物，由Invitrogen公司合成。上游引物Pxp38-F：5′-ATGCCGAGGTATCACAAAGTGG-3′，下游引物Pxp38-R：5′-CTACCTATAGTTCGGGGTCG-3′。

1.4小菜蛾總RNA的提取、cDNA第一鏈合成和PCR條件

取小菜蛾幼蟲100 mg，液氮冷凍研磨后，用Trizol法提取小菜蛾總RNA，具體步驟參照Invitrogen公司的Trizol試劑說明書，最后溶解于 30 μl DEPC水中，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，將其直接用于RT-PCR或-80℃保存。

取1 μg總RNA，參照Invitrogen公司的SuperScript cDNA合成試劑盒說明書，以O(shè)ligo（dT）18作為逆轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)設(shè)置實驗組和對照組，實驗組加逆轉(zhuǎn)錄酶，對照組不加逆轉(zhuǎn)錄酶。

以實驗組和對照組逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用引物Pxp38-F和Pxp38-R進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min； 94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，30 個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.5重組質(zhì)粒pMD18T-Pxp38 ORF的構(gòu)建與鑒定

將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收，取100 ng與25 ng pMD18-T載體16℃下連接4 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB+Amp平板上通過藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化子，挑取3個白斑轉(zhuǎn)化子接種到液體LB+Amp培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，利用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ對其進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍照。

1.6生物信息學(xué)分析

利用Chromas軟件分析DNA測序結(jié)果；通過Vector NTI軟件根據(jù)p38 ORF序列推導(dǎo)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)；通過SMART網(wǎng)站（http：//smartembl-heidelbergde/）分析預(yù)測小菜蛾P(guān)xp38蛋白結(jié)構(gòu)域；利用Blast軟件比較不同物種間p38蛋白一級結(jié)構(gòu)的同源性；小菜蛾基因組數(shù)據(jù)庫DBM-DB的網(wǎng)址是http：//wwwiaefafueducn/dbm/。

2結(jié)果與分析

2.1Pxp38基因ORF的獲得

利用引物Pxp38-F和Pxp38-R克隆Pxp38基因的ORF片段，結(jié)果如圖1所示，實驗組得到了大小約1 kb的單一DNA條帶，對照組只得到了非特異性雜帶，說明成功獲得了Pxp38基因的ORF片段。

3討論 本研究首次克隆了小菜蛾的Pxp38 MAPK基因，并對其進行了生物信息學(xué)分析，揭示出Pxp38基因是一個潛在的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，從最簡單的真核模式生物釀酒酵母到高等哺乳動物人類的細(xì)胞中都保守存在。本研究為進一步深入探討Pxp38 MAPK基因的功能，揭示小菜蛾響應(yīng)外界脅迫以及產(chǎn)生藥物耐受的分子機制提供了基礎(chǔ)，為開辟小菜蛾防治新途徑提供參考。

參考文獻：

[1]Talekar N S， Shelton A M Biology， ecology， and management of the diamondback moth [J] Annu Rev Entomol ， 1993， 38： 275-301

[2]Furlong M J， Wright D J， Dosdall L M Diamondback moth ecology and management： problems， progress， and prospects [J] Annu Rev Entomol ， 2013， 58： 517-541

[3]Tabashnik B E， Huang F， Ghimire M N， et al Efficacy of genetically modified Bt toxins against insects with different genetic mechanisms of resistance [J] Nat Biotechnol， 2011，29（12）：1128-1131

[4]Baxter S W， Badenes-Pérez F R， Morrison A， et al Parallel evolution of Bacillus thuringiensis toxin resistance in lepidoptera [J] Genomics， 2011， 189（2）： 675-679

[5]He W， You M， Vasseur L， et al Developmental and insecticide-resistant insights from the de novo assembled transcriptome of the diamondback moth， Plutella xylostella [J] Genomics， 2012， 99（3）： 169-177

[6]Li X， Schuler M A， Berenbaum M R Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics[J] Annu Rev Entomol ， 2007， 52： 231-253

[7]You M， Yue Z， He W， et al A heterozygous moth genome provides insights into herbivory and detoxification [J] Nat Genet ， 2013， 45（2）： 220-225

[8]Manning G， Whyte D B， Martinez R， et al The protein kinase complement of the human genome [J] Science， 2002， 298（5600）： 1912-1934

[9]Gustin M C， Albertyn J， Alexander M， et al MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae [J] Microbiol Mol Biol Rev ， 1998， 62（4）： 1264-1300

[10]Rodriguez M C， Petersen M， Mundy J Mitogen-activated protein kinase signaling in plants [J] Annu Rev Plant Biol ， 2010， 61： 621-649

[11]Pearson G， Robinson F， Beers Gibson T， et al Mitogen-activated protein （MAP） kinase pathways： regulation and physiological functions [J] Endocr Rev ， 2001， 22 （2）： 153-183

[12]Theodosiou A， Ashworth A MAP kinase phosphatases [J] Genome Biol ， 2002， 3（7）： REVIEWS3009