賴崇德

【摘 要】目的： 研制人血清中促甲狀腺素（TSH）的化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。方法： 采用辣根過氧化物酶標記的抗TSHβ亞單位特異性單克隆抗體（mAb）， 與固相包被的抗TSHα亞單位的另一mAb配對， 以魯米諾作為底物， 采用兩步法建立了雙位點夾心法人血清TSH的化學發(fā)光免疫定量分析法。結果： 該方法靈敏度為0.0788 mIU/L， 批內(nèi)CV平均為4.7%， 批間CV平均為8.4%， 平均回收率為93.05%。該檢測與LH、 FSH和HCG無交叉反應。

【關鍵詞】促甲狀腺激素（TSH）；化學發(fā)光免疫分析法；試劑盒

甲狀腺功能改變時， TSH的波動較甲狀腺激素更迅速且明顯， 是反映下丘腦、垂體、甲狀腺軸功能的敏感指標， 因此采用靈敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意義?；瘜W發(fā)光免疫分析（chemiluminescent immunoassay， CLIA）是一種靈敏的免疫分析方法， 在免疫診斷試劑研制中已得到了廣泛的應用[3]。本研究根據(jù)化學發(fā)光免疫分析法的原理研制了血清TSH的檢測試劑盒， 與國內(nèi)外同類產(chǎn)品相比具有簡便、快捷、成本低等優(yōu)點。

1 材料和方法

1.1 材料 TSH單克隆抗體（mAb）、 TSH標準品抗原和辣根過氧化物酶（HRP）為Sigma公司產(chǎn)品， 光免板為Thermo Electron公司產(chǎn)品， 化學發(fā)光底物為BioRad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 標準品的配制 將TSH抗原標定后溶于小牛血清中， 配制成含0.1， 1， 5， 20， 100 mIU/L的標準溶液。

1.2.2 抗體包被板的制備 將100μL含TSH mAb（0.5mg/L）的pH9.6碳酸鹽緩沖液加至包被板中， 37℃包被2 h， 再用含10 mg/L BSA的0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液于37℃封閉2 h后晾干備用。

1.2.3 酶標記物的制備 TSH的酶標記物采用過碘酸鈉法制備， 然后經(jīng)0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液透析過夜后， 加入等量的甘油于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 檢測方法 將50 μL待測樣品或標準品加入包被TSH的光免板中， 37℃溫育30 min， 棄反應液， 用洗滌液（含0.5 mg/L Tween20的0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液）洗5次， 加酶標記物50 μL， 37℃溫育30 min后同樣用洗滌液洗5次， 然后加入發(fā)光底物于5～10 min內(nèi)測定各孔的發(fā)光值RLU。樣本中的TSH濃度依據(jù)由標準品TSH濃度和對應的RLU建立的數(shù)學模型進行定量。

2 結果

2.1 動力學性質(zhì) 在HRP魯米諾H2O2發(fā)光體系中， 將不同量的免疫復合物加入發(fā)光液中， 發(fā)光強度（RLU）隨反應時間而變化。10 min后RLU接近峰值， 在5～15 min內(nèi)RLU較為穩(wěn)定， 隨后開始緩慢下降。

2.2 反應條件優(yōu)化

2.2.1 加樣量對RLU的影響 樣本和酶標記物的加樣量分別為50μL和100μL考查標準品（0、0.1、1、5、20、100 mIU/L）RLU， 發(fā)現(xiàn)加樣量為100μL與50μL RLU相差不大， 說明50 μL的加樣量反應能達到平衡。

2.2.2 反應模式對RLU的影響 采用二步法。第一步： 加入標準品和待測樣品后， 將反應體系在37℃分別溫育15、30、45、60 min； 第二步： 加入酶標記抗體后， 將反應體系在37℃分別溫育15、30、45、60 min。結果表明溫育時間為30 min時反應皆能達到平衡。

A： 第一步溫育時間對RLU的影響； B： 第二步溫育時間對RLU的影響.

2.3 穩(wěn)定性 將試劑盒放置于37℃ 6 d后， 比較與放置前參考標準品各點RLU值， 參考標準品各點RLU值未見明顯降低， 且本底發(fā)光值無明顯升高， 表明試劑盒標準曲線無明顯漂移， 滿足穩(wěn)定性要求。

2.4 方法學評價

2.4.1 標準曲線與靈敏度 在設定的免疫反應和發(fā)光條件下， 以標準血清的濃度（0～100 mIU/L）制作的標準曲線見圖3。同時測定20個零標準， 用零標準均值加上2倍標準差， 計算出此方法的靈敏度為0.0788 mIU/L。

2.4.2 精密度 取低（4.44 mIU/L）、中（19.45 mIU/L）和高（79.23 mIU/L）3種TSH濃度各重復測定10次， 測定批內(nèi)CV分別為6.2%、3.3%和4.6%，平均為4.7%。隔日分別進行5次獨立試驗， 測批間CV分別為8.3%、7.6%和9.3%， 平均為8.4%。

2.4.3 準確性 在已知TSH濃度的血清中加入3種不同濃度的標準血清，測定加入回收率為93.05%。將TSH濃度為44.42 mIU/L的血清用標準零血清分別按1/2、1/4、1/8、1/16稀釋， 測量各稀釋濃度的TSH含量， 測定稀釋回收率為99.86%。

2.4.4 特異性 在已知濃度的血清樣品中加入不同濃度的LH、FSH和HCG后， 對TSH的測定無干擾。

2.4.5 與進口試劑的比較 將研制的TSH CLIA定量檢測試劑盒與Abbott architect i2000全自動化學發(fā)光系統(tǒng)共同對30例正常人、20例甲亢及80例甲低臨床標本進行檢測， 通過數(shù)據(jù)分析， 得出兩個檢測系統(tǒng)所得數(shù)值具有明顯相關性。

3 討論

血清促甲狀腺素定量檢測的方法主要有放射免疫法、 酶聯(lián)免疫法、 時間分辨熒光免疫法和化學發(fā)光免疫法等幾種[4]。考慮到目前化學發(fā)光和時間分辨熒光分析儀器幾乎全部為國外廠商生產(chǎn)， 而絕大多數(shù)廠商采用儀器加試劑盒捆綁銷售的壟斷模式， 并在儀器中人為設置排它性檢測程序， 從而抬高了配套試劑盒價格， 增加了檢測成本， 所以本工作旨在開發(fā)國產(chǎn)低價、 穩(wěn)定、 通用的人血TSH CLIA試劑盒。首先對讀數(shù)時間進行了動力學研究， 發(fā)現(xiàn)其在5～15 min內(nèi)RLU處于平臺期，反應時間選擇10 min。其次對反應條件進行了實驗摸索， 在不同的溫育時間和加樣量的條件下， 各RLU值相差不大， 因此選擇了50 μL的加樣量與兩步共1 h的反應時間。

我們研制的TSH化學發(fā)光免疫測定試劑盒通過方法學鑒定表明無論是靈敏度、 準確性、 特異性等技術指標均達到了臨床診斷的要求[5]； 同時該方法具有操作方便， 反應時間短和成本低等優(yōu)點， 具有較廣闊的市場應用前景。