曹玉美，方茜，陸江，孫如水，孫龍

（廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場(chǎng)，廣西 橫縣 530317）

當(dāng)前疫苗生產(chǎn)中普遍采用牛血清作為細(xì)胞培養(yǎng)的主要成分，這導(dǎo)致疫苗中不同程度地殘留有牛血清蛋白，牛血清殘余蛋白對(duì)于機(jī)體來說是一種異源蛋白，如果殘留種類多，注射疫苗后就可能引起過敏性休克等不良反應(yīng)[1]。目前已見報(bào)道的過敏成分主要是牛血清白蛋白（BSA）和牛血清IgG（B-IgG）。為了有效控制過敏原含量，《中國(guó)生物制品規(guī)程（2000年版）》明確規(guī)定疫苗中牛血清蛋白的殘余量不得超過50ng/mL[2]。由于疫苗質(zhì)量的安全性越來越受到關(guān)注，因此，建立檢測(cè)疫苗中牛血清蛋白殘留量的方法和研制相關(guān)試劑盒具有十分重要的意義。早在2004年國(guó)內(nèi)已經(jīng)研制出能定量檢測(cè)牛血清蛋白含量的酶聯(lián)免疫試劑盒，市面上也出現(xiàn)了許多廠家研制的檢測(cè)牛血清蛋白含量的ELISA試劑盒，而眾多試劑盒的檢測(cè)效果存在差異，選擇一款穩(wěn)定性好、靈敏度高的試劑盒成為有效控制牛血清蛋白含量的關(guān)鍵。本試驗(yàn)從市面上選購了3種用于檢測(cè)豬瘟疫苗中牛血清蛋白含量的ELISA試劑盒（分別為A、B、C），由本實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)這3種試劑盒進(jìn)行各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)驗(yàn)證，并分別用其對(duì)18個(gè)豬瘟疫苗樣品進(jìn)行牛血清蛋白含量檢測(cè)，以此評(píng)價(jià)這3種試劑盒用于常規(guī)疫苗質(zhì)量控制的可行性。

1 材料

1.1 檢測(cè)儀器及試劑 酶標(biāo)儀；ELISA試劑盒A（生產(chǎn)批號(hào)：201708），其檢測(cè)范圍為 1～45ng/mL；ELISA試劑盒B（生產(chǎn)批號(hào)：2017082809），其檢測(cè)范圍為1～45 ng/mL；ELISA 試劑盒 C（生產(chǎn)批號(hào)：201708），其檢測(cè)范圍為0.5～80ng/mL。所有試劑盒均在保質(zhì)期內(nèi)使用。

1.2 待檢樣品 選擇18個(gè)豬瘟疫苗作為待檢樣品。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確按照試劑盒的操作說明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，通過對(duì)比3種試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程的相關(guān)性及變異系數(shù)來驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定性。具體操作步驟如下：

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋 準(zhǔn)備5支稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每支EP管加入150μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，將試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品原液進(jìn)行倍比稀釋，得到5個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，試劑盒A的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為2.5、5、10、20、40ng/mL，試劑盒B的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為2.5、5、10、20、40ng/mL，試劑盒 C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度分別為5、10、20、40、80ng/mL。

2.1.2 加樣 將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)均勻，并設(shè)置空白孔（不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同）。

2.1.3 溫育 用封口膜封板后置37℃恒溫箱中溫育30min。

2.1.4 配液 將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后使用。

2.1.5 洗滌 小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去。如此重復(fù)5次，拍干。

2.1.6 加酶 每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。

2.1.7 溫育、洗滌 操作同上。

2.1.8 顯色 每孔加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10min。

2.1.9 終止 每孔加入終止液50μL，終止反應(yīng)。

2.1.10 測(cè)定 以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)讀取各孔吸光度值。

2.2 豬瘟疫苗樣品檢測(cè) 準(zhǔn)確按照試劑盒的操作說明對(duì)本場(chǎng)的18個(gè)豬瘟疫苗樣品進(jìn)行牛血清蛋白含量測(cè)定，每個(gè)樣品做兩個(gè)重復(fù)，取平均值。具體操作同2.1步驟，只是在加樣時(shí)先加入40 μL樣品稀釋液，再加入10 μL待測(cè)樣品，最終將樣品稀釋5倍，其余步驟均相同。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線性方程和樣品吸光度，測(cè)得樣品中牛血清蛋白的含量，并對(duì)其變異系數(shù)進(jìn)行對(duì)比，比較檢測(cè)結(jié)果的差異及符合程度。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 3種試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)詳見表1。試劑盒A的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.079 1x+0.4997，相關(guān)系數(shù)為0.9692；試劑盒B的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0350x-0.0089，相關(guān)系數(shù)為0.9948；試劑盒C的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0045x+0.0787，相關(guān)系數(shù)為0.9884?？梢娫噭┖蠦的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性較高。

表1 3種試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)

3種試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的變異系數(shù)詳見圖1。由圖可知，試劑盒A的變異系數(shù)在0.005～0.115之間，試劑盒B的變異系數(shù)在0.005～0.439之間，試劑盒C的變異系數(shù)在0.104～0.260之間。可見試劑盒A標(biāo)準(zhǔn)曲線的變異系數(shù)最小。

圖1 3種試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的變異系數(shù)

3.2 豬瘟疫苗樣品中牛血清蛋白含量的測(cè)定 3種試劑盒對(duì)18個(gè)豬瘟疫苗樣品檢測(cè)所得到的結(jié)果詳見表2。使用試劑盒A檢測(cè)時(shí)，樣品濃度均為負(fù)值，說明樣品中未檢出牛血清蛋白。使用試劑盒B對(duì)相同樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品中牛血清蛋白的含量在36.99～57.27ng/mL之間，而試劑盒B的檢測(cè)范圍為1～45ng/mL，其中有10個(gè)樣品濃度超出了檢測(cè)范圍，并且有7個(gè)樣品的牛血清蛋白含量超標(biāo)（＞50ng/mL）。由于含量超過試劑盒檢測(cè)范圍，試劑盒B的檢測(cè)結(jié)果有待考證，需要對(duì)樣品稀釋后進(jìn)行再次檢查。使用試劑盒C檢測(cè)樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)樣品中牛血清蛋白的含量在28.07～39.96ng/mL之間，其含量均在試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)，且低于生物制品規(guī)程中的相關(guān)規(guī)定。

表2 3種試劑盒檢測(cè)疫苗樣品中的牛血清蛋白含量 ng/mL

圖2 3種試劑盒檢測(cè)樣品時(shí)的變異系數(shù)

3種試劑盒在檢測(cè)18個(gè)豬瘟疫苗樣品時(shí)吸光度值的變異系數(shù)詳見圖2。由圖可知，試劑盒A的變異系數(shù)在0.002～0.186之間，試劑盒B的變異系數(shù)在0.003～0.124之間，試劑盒 C的變異系數(shù)均小于0.063。可見用3種試劑盒檢測(cè)樣品時(shí)，試劑盒C的變異系數(shù)最小。

4 討論

酶聯(lián)免疫吸附法是一種與國(guó)際接軌的檢測(cè)方法，主要通過制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定相關(guān)系數(shù)，再通過直線范圍內(nèi)的吸光度值來計(jì)算出樣品中的牛血清蛋白含量，可以對(duì)樣品進(jìn)行定量測(cè)定，并且具有特異性好、靈敏度佳的優(yōu)點(diǎn)[3]。早在2004年，國(guó)內(nèi)就已經(jīng)研制出了用于檢測(cè)牛血清蛋白的ELISA試劑盒，經(jīng)過驗(yàn)證，具有較好的準(zhǔn)確度、靈敏度和可重復(fù)性，且操作快捷。本試驗(yàn)對(duì)3個(gè)不同生產(chǎn)廠家的ELISA試劑盒進(jìn)行了各項(xiàng)質(zhì)量參數(shù)驗(yàn)證，對(duì)比其用于常規(guī)疫苗質(zhì)量控制的可行性。

通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以看到3種試劑盒的相關(guān)系數(shù)均在0.95以上，相關(guān)系數(shù)最好的是試劑盒B，其次為試劑盒C，試劑盒A最差。但從標(biāo)準(zhǔn)曲線的變異系數(shù)來看，試劑盒A與試劑盒C的變異系數(shù)趨勢(shì)較一致，波動(dòng)較小，特別是試劑盒A的變異系數(shù)均在0.115以內(nèi)；而試劑盒B的變異系數(shù)波動(dòng)較大（有兩個(gè)點(diǎn)的變異系數(shù)高于0.35），說明其標(biāo)準(zhǔn)曲線離散度大于其他兩種試劑盒。

在使用3種試劑盒檢測(cè)疫苗樣品中的牛血清蛋白含量時(shí)，試劑盒A的結(jié)果均為負(fù)值，說明未檢出，而試劑盒B與試劑盒C的結(jié)果均顯示樣品中含有不同濃度的牛血清蛋白，且試劑盒B的檢測(cè)結(jié)果顯示有7份樣品的牛血清蛋白含量高于50ng/mL，超標(biāo)率為38.88%，而試劑盒C的結(jié)果顯示18個(gè)樣品的牛血清蛋白含量均在規(guī)定范圍內(nèi)。從檢測(cè)樣品的變異系數(shù)來看，試劑盒A的變異系數(shù)較大，波動(dòng)幅度大于其他兩種試劑盒，而試劑盒B與試劑盒C有較一致的變異趨勢(shì)，且試劑盒C的變異系數(shù)最小。說明在檢測(cè)樣品時(shí)，試劑盒C的重復(fù)性優(yōu)于其他兩種試劑盒。

5 結(jié)論

整體而言，試劑盒C表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性和可操作性，具有較好的相關(guān)性及可重復(fù)性。由于3種試劑盒所測(cè)樣品的牛血清蛋白含量的差異較大，無法最終判斷疫苗樣品中牛血清蛋白的含量，故建議使用已知濃度的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行再次檢測(cè)，以確定試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；也可以在檢測(cè)時(shí)，適當(dāng)將疫苗樣品稀釋，然后進(jìn)一步檢測(cè)。綜上所述，3種試劑盒的優(yōu)劣各有千秋，還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。