徐莎等

【摘 要】目的：PCR擴(kuò)增小鼠LIGHT胞外段基因（LIGHTECD），構(gòu)建含LIGHTECD的原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，并免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體。方法：提取小鼠骨髓來(lái)源的未成熟樹突狀細(xì)胞中的總mRNA，RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增LIGHTECD，克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6P-2中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-6P-2-LIGHTECD。重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和基因測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1 Blue，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。融合蛋白純化后純化后免疫新西蘭兔，ELISA 及Western- blot 分析兔血清中抗LIGHTECD抗體的效價(jià)和特異性。結(jié)果：RT-PCR擴(kuò)增得到525 bp LIGHTECD目的片段；經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定，證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒中插入的片段為L(zhǎng)IGHTECD基因，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與Genbank上登錄序列完全一致；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組質(zhì)粒表達(dá)一相對(duì)分子量（Mr）約為45kD的目的蛋白條帶。ELISA 檢測(cè)免疫兔血清效價(jià)為1∶20 000。結(jié)論：成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因，并表達(dá)了相應(yīng)可溶性蛋白，準(zhǔn)備了高效價(jià)的兔抗LIGHTECD多克隆抗體，為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】LIGHT；原核表達(dá)；免疫原性；多克隆抗體

LIGHT （lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for herpesvirus entry on T cells）最早是Mauri等[1]在對(duì)單純皰疹病毒入侵活化T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)的，是腫瘤壞死因子超家族的第14個(gè)成員，又名HVEM-L （Herpesvirus entry mdeiator-Ligand）或TNFSF14，是一種非CD28依賴的協(xié)同刺激分子。LIGHT是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，多以三聚體形式表達(dá)于活化的T細(xì)胞、未成熟DC、單核細(xì)胞、脾細(xì)胞及粒細(xì)胞膜上，也可以分泌型形式存在[2]。目前已經(jīng)證實(shí)TNFSF14可以與3 種膜結(jié)合型的TNF受體家族成員結(jié)合，即TNFRSF14、LTβR （ lymphotoxinβ receptor）和DcR3，啟動(dòng)不同的生物學(xué)效應(yīng)?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)，TNFSF14信號(hào)通路通過(guò)刺激T細(xì)胞增殖、分化和誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，在抗腫瘤免疫、誘導(dǎo)自身免疫病和移植排斥反應(yīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)觸突的發(fā)育和脂代謝及抗感染免疫中發(fā)揮重要功能[3-9]。

LIGHT作為一個(gè)多功能多效應(yīng)分子，具有共刺激和細(xì)胞毒等活性，克隆LIGHT基因并獲得其重組蛋白對(duì)研究該蛋白的生物學(xué)功能具有重要作用。而LIGHT胞外段基因（LIGHTECD）是其與相應(yīng)受體結(jié)合，從而發(fā)揮作用的關(guān)鍵部位，因此本實(shí)驗(yàn)擬克隆LIGHTECD，構(gòu)建原核表達(dá)載體，表達(dá)可溶性蛋白，并制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、質(zhì)粒及主要試劑

4～6w雄性C57BL/6小鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。E.coli XL-1 Blue及原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-2均由本研究所保存。rmIL-4（cat#404- ML）、rmGM-CSF（cat#415- ML） 購(gòu)自R&D公司。DNA膠回收純化試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶（BamHⅠ，NotⅠ）均購(gòu)自TaKaRa公司。細(xì)胞總mRNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司

1.2 樹突狀細(xì)胞總mRNA的提取及cDNA的合成

收集小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞，體外用rmIL-4和rmGM-CSF刺激，誘導(dǎo)分化為未成熟樹突狀細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，用細(xì)胞總mRNA提取試劑盒按說(shuō)明書操作提取細(xì)胞總mRNA，紫外分光光度法測(cè)定其濃度和純度后保存。按RT-PCR試劑盒介紹的方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 小鼠LIGHT胞外段基因的擴(kuò)增

根據(jù)Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)小鼠LIGHT基因序列，對(duì)照pGEX-6p-2載體上的多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)LIGHTECD的特異性擴(kuò)增引物。上游引物為：5′-CGG▼GATCCATAGTAGCTCATCTGCCAGA-3′，下劃線序列為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物為：5′-ATAAGAATGC▼GGCCGCTCAGACCATGAAAGCTCCG-3′，下劃線序列為NotⅠ酶切位點(diǎn)。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增LIGHTECD。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃ 3min后，進(jìn)入變性94℃ 30s ，退火58℃ 30s，延伸72℃ 45s的循環(huán)，共計(jì)35次，末次循環(huán)后補(bǔ)延72℃ 10min，終止反應(yīng)。經(jīng)電泳鑒定后，用DNA膠回收純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.4 小鼠LIGHT胞外段基因的克隆及鑒定

純化的LIGHTECD PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pGEX-6p-2空質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后，用T4 DNA Ligase 連接，轉(zhuǎn)化至E.coli XL-1 Blue感受態(tài)細(xì)胞中，用含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，篩選陽(yáng)性克隆并用PCR初步鑒定。挑取PCR初篩陽(yáng)性的單個(gè)菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒送往北京賽諾基因組研究中心測(cè)序，序列正確的重組質(zhì)粒命名為pGEX-6p-2-LIGHTECD。

1.5 小鼠LIGHT蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析

挑取經(jīng)測(cè)序鑒定的陽(yáng)性菌落到LB液體培養(yǎng)基（含有100 μg/ml 氨芐青霉素）中，37℃ 培養(yǎng)16～18h。按1∶100比例接種于400 ml 含100 μg/ml 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基中后，37℃ 培養(yǎng)至A600 nm達(dá)0.8。加入IPTG（終濃度為200 μmol/L），22℃ 振蕩培養(yǎng)5 h，同時(shí)設(shè)不加IPTG組作為對(duì)照。6000 r/min 離心收集細(xì)菌，將細(xì)菌沉淀重懸于20 ml 含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，超聲。4℃，15000 r/min 離心15 min，收集上清，分裝，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。? ml上清液，加20 μl PBS 洗滌過(guò)的谷胱苷肽瓊脂糖珠4B，室溫旋轉(zhuǎn)孵育1 h，離心收集谷胱苷肽瓊脂糖珠， 用0.25% PBST洗滌2次，再用PBS洗滌1次后，得到純化的融合蛋白。經(jīng)12% SDS-PAGE 凝膠電泳，Coomassie blue染色，鑒定融合蛋白的表達(dá)情況。

1.6 動(dòng)物免疫

取100μL 融合蛋白，加入等體積弗氏完全佐劑，超聲充分乳化后，皮下多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔。第一次免疫2w后，取100μL融合蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑超聲乳化進(jìn)行后，免疫第2次，間隔2w進(jìn)行免疫第3次。同時(shí)設(shè)PBS免疫組為對(duì)照。免疫前及末次免疫后7d，心臟采血，分離兔血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 抗體效價(jià)測(cè)定

用間接ELISA法測(cè)定兔免疫血清中特異性抗體效價(jià)。用10μg/mL LIGHTECD抗原包被酶標(biāo)板，每孔100μl，同時(shí)設(shè)GST蛋白和空白對(duì)照。4℃包被過(guò)夜，0.05%PBST 洗滌3 次后，用10%BSA 室溫封閉1 h，加入倍比稀釋的待測(cè)兔免疫血清，37℃溫育1 h，用0.05%PBST 洗滌3 次，分別加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃溫育1 h，充分洗滌后，加入顯色劑ABTS，37℃避光溫育5～10min，用2mol/L H2SO4 終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取405 nm波長(zhǎng)處OD值。實(shí)驗(yàn)組OD405 大于或等于GST 對(duì)照孔2倍以上判為陽(yáng)性，以陽(yáng)性者的血清最高稀釋度定義為抗體效價(jià)，即抗體滴度。

1.8 融合蛋白免疫反應(yīng)性鑒定

將純化的LIGHTECD融合蛋白進(jìn)行SDS- PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉封閉后，以免疫兔血清為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行Western blot 分析，鑒定LIGHTECD融合蛋白的免疫反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1 LIGHTECD的PCR擴(kuò)增

提取小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞總mRNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到525 bp大小的目的DNA片段，大小與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒pGEX-6p-2-LIGHTECD用LIGHTECD特異性引物擴(kuò)增得到525bp的目的片段，經(jīng)序列測(cè)定，Blast軟件分析測(cè)序結(jié)果結(jié)果表明擴(kuò)增的目的基因序列與GenBank上登錄號(hào)為GI：133892635的基因同源性為100%，且密碼子讀碼框架正確。

2.3 LIGHTECD的表達(dá)分析

將經(jīng)測(cè)序鑒定的陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli XL-1 Blue表達(dá)菌中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，提取菌體總蛋白，并經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖珠4B純化后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，約在45kD處出現(xiàn)一特異性蛋白條帶，與預(yù)期目的蛋白大小一致，表明LIGHTECD在原核系統(tǒng)內(nèi)得到表達(dá)（圖3）。

2.4 LIGHTECD融合蛋白免疫原性鑒定

用間接ELISA 法測(cè)定兔免疫血清中抗LIGHTECD特異性抗體產(chǎn)生水平。結(jié)果顯示：最高抗體滴度達(dá)1∶20 000，而PBS免疫對(duì)照組小鼠血清抗體未檢測(cè)出特異性的抗體，提示LIGHTECD融合蛋白可刺激新西蘭大白兔產(chǎn)生免疫反應(yīng)，該蛋白具有很好的免疫原性。

2.5 LIGHTECD蛋白免疫反應(yīng)性鑒定

用LIGHTECD兔免疫血清作一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為二抗，進(jìn)行Western-blot分析。結(jié)果顯示：純化的LIGHTECD重組蛋白在約45kDa 處出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)帶，而只表達(dá)GST的空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)純化產(chǎn)物未出現(xiàn)條帶，表明兔免疫血清能特異性識(shí)別LIGHTECD融合蛋白（圖3），該蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

3 討論

LIGHT是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子超家族的第14個(gè)成員，主要表達(dá)在激活的T淋巴細(xì)胞和未成熟DC（iDC）上，并具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)iDC成熟，促進(jìn)Thl型細(xì)胞因子產(chǎn)生的功能。ILGHT在不同組織和細(xì)胞中的選擇性表達(dá)，與其在免疫反應(yīng)中的不同調(diào)節(jié)作用有關(guān)，通過(guò)與不同靶細(xì)胞上表達(dá)的受體結(jié)合，LIGHT可啟動(dòng)不同的生物學(xué)效應(yīng)。

本研究分離小鼠骨髓來(lái)源的樹突狀細(xì)胞，在其中加入IL-4和GM-CSF，誘導(dǎo)其分化為未成熟DC，以高表達(dá)LIGHT。GM-CSF可以誘導(dǎo)DC前體增殖分化，并在體外維持DC的活性，是維持DCs發(fā)育及分化最根本的細(xì)胞因子；IL-4則能抑制培養(yǎng)物中粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的分化增殖，有利于DC分化并維持DCs于未成熟狀態(tài)。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)分化未成熟DC。

LIGHT胞外段基因長(zhǎng)525bp，編碼175個(gè)氨基酸。本文從小鼠樹突狀細(xì)胞上成功擴(kuò)增得到LIGHT胞外段基因片段，與原核表達(dá)載體pGEX-6p-2連接，構(gòu)建了pGEX-6p-2-LIGHTECD原核表達(dá)系統(tǒng)。將pGEX-6p-2-LIGHTECD重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli XL1 Blue，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出可溶性LIGHTECD融合蛋白。

使外源基因在原核細(xì)胞中高效表達(dá)的前提是選擇高效的表達(dá)載體和合適的工程。本研究選擇的pGEX-6p-2表達(dá)載體，是經(jīng)pBR322質(zhì)粒改造而來(lái)的一種原核表達(dá)載體，采用tac啟動(dòng)子，tac啟動(dòng)子是一種由lac啟動(dòng)子（乳糖操縱子）和trp啟動(dòng)子（色氨酸操縱子）人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子，它是一種非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，可使mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高，誘導(dǎo)外源基因在宿主菌中高效表達(dá)；而且它是一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型表達(dá)載體在沒(méi)有誘導(dǎo)物的情況下，外源基因不表達(dá)，宿主菌的生長(zhǎng)不受目的蛋白的影響，當(dāng)宿主菌生長(zhǎng)到一定量時(shí)，加入誘導(dǎo)物IPTG，啟動(dòng)目的蛋白的表達(dá)，由此可以獲得較高產(chǎn)量的目的蛋白。它含有GST的編碼序列，可使表達(dá)的外源重組蛋白融合入一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量約為26 kD 的 GST純化標(biāo)簽，該標(biāo)簽對(duì)表達(dá)蛋白的有效純化和保持蛋白質(zhì)的天然生物學(xué)活性作用重大。

除了所選擇的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)菌種可影響目的蛋白的表達(dá)及其表達(dá)量外，誘導(dǎo)劑的濃度、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間等也均可在一定程度上影響目的蛋白的表達(dá)。本文對(duì)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行了系列探索，結(jié)果顯示：誘導(dǎo)劑IPTG濃度為200μmol/L、在22℃誘導(dǎo)5h時(shí)蛋白表達(dá)量較高，并以可溶性形式表達(dá)。張亞麗[10]等也構(gòu)建了LIGHT胞外段的原核表達(dá)載體，他們選擇的是pET-24a原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的蛋白主要以包涵體形式存在。本文構(gòu)建的pGEX-6p-2-LIGTHECD明顯優(yōu)于其構(gòu)建的pET-24a-LIGTHECD原核表達(dá)重組體，利于目的蛋白的純化及功能研究。

用該重組蛋白免疫新西蘭兔制備免疫血清，ELISA測(cè)定特異性抗體滴度達(dá)1∶20 000，說(shuō)明該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。Western Blot 結(jié)果顯示該原核表達(dá)的融合蛋白能與相應(yīng)的抗體特異性結(jié)合。

本研究成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEX-6p-2-LIGHTECD，并得到相應(yīng)的可溶性蛋白和兔免疫血清，為下一步的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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