孫偉等

【摘 要】目的：探討線粒體銅伴侶蛋白COX17在胃癌發(fā)中的表達(dá)。方法：利用Real-Time PCR法以及Western blot法檢測胃癌中線粒體銅伴侶蛋白基因COX17基因的表達(dá)水平。結(jié)果：COX17的mRNA及蛋白表達(dá)水平在胃癌組織中均表現(xiàn)為低表達(dá)（15/20，75%），差異具有顯著性（P<0.001）。結(jié)論 銅伴侶蛋白COX17在胃癌中異常表達(dá)，可能與胃癌發(fā)生有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】COX17；胃癌；表達(dá)

【中圖分類號(hào)】R735.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】

COX17是一種分子量約為8kDa的線粒體銅伴侶蛋白，其蛋白異常表達(dá)量與活性氧自由基形成有關(guān)，可能繼發(fā)導(dǎo)致基因變異導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此有必要闡明COX17在胃癌中的表達(dá)，初步探討COX17在腫瘤形成中的可能角色。

1 材料與方法

1.1 材料

20例胃腫瘤組織標(biāo)本來自青海大學(xué)附屬醫(yī)院于2005年5月至10月收治的胃腫瘤患者（男13例），年齡51～87歲。所有標(biāo)本均由胃癌組織及相距5 cm以上的癌旁正常組織配對(duì)組成，標(biāo)本置液氮，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR法（Quantity Real-Time PCR）

利用iCycler iQTM Real-Time PCR反應(yīng)系統(tǒng) （Bio-Rad，USA），以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。引物序列：COX17：上游5′- ATT TGG CTG TCT CCG CTC AT-3′，下游5′- TGT GGG CCT CAA TTA GAT GTC-3′，擴(kuò)增長度197 bp；β-actin：上游5′-TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC- 3′，下游5′-ACC TTC ACC GTT CCA GTT T-3′，擴(kuò)增長度150 bp。每個(gè)樣本設(shè)立3個(gè)平行反應(yīng)管，相同樣本間擴(kuò)增CT值小于0.5，取平均值后用于定量計(jì)算及分析。PCR參數(shù)：94 ℃變性5 min；進(jìn)入循環(huán)后94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)44圈；72 ℃充分延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后從55 ℃到95 ℃按每級(jí)0.5 ℃遞增作出溶解曲線。

1.2.3 免疫組織化學(xué)

免疫組織化學(xué)方法：石蠟切片經(jīng)80℃烤片2小時(shí)，二甲苯脫蠟30分鐘兩次，梯度酒精100%、95%、90%、85%、80%依次水化5分鐘；切片放入EDTA（PH8.0）抗原修復(fù)高壓抗原修復(fù)150秒，冷卻至室溫后1PBS洗片3次，每次5分鐘，加入3℅過氧化氫溶液10分鐘以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，1PBS浸泡5分鐘；5%脫脂奶粉室溫封閉1小時(shí)，傾去多余封閉液，滴加抗COX17一抗 （Santa Cruz，USA）， 1：500稀釋，4℃冰箱過夜；1PBS洗片3次，每次5分鐘。滴加二抗，室溫1小時(shí)；1PBS洗片3次，每次5分鐘。用新鮮配置的DAB顯色液（Dako， UK）顯色10分鐘，流水充分沖洗。蘇木素復(fù)染10秒，自來水沖洗，1%鹽水酒精去浮色2秒，溫水返蘭。梯度酒精回水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

定量PCR結(jié)果利用ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算癌組織中基因表達(dá)相對(duì)于癌旁正常組織變化倍數(shù)后取2的對(duì)數(shù)，大于0的樣本為高表達(dá)，小于0的樣本為低表達(dá)。癌與癌旁表達(dá)差異用t檢驗(yàn)及百分比同時(shí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌和癌旁正常組織中COX17 mRNA的差異表達(dá)

對(duì)20對(duì)胃癌和癌旁正常組織提取RNA并逆轉(zhuǎn)為cDNA進(jìn)行Realtime-PCR實(shí)驗(yàn)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果作圖（圖1）。我們發(fā)現(xiàn)有15對(duì)（15/20，75%）胃癌組織中的COX17基因 mRNA 表達(dá)水平低于與其配對(duì)的癌旁正常組織，胃癌與癌旁正常組織COX17 mRNA表達(dá)差異具有顯著性（表1. p<0.001）。

2.2 胃癌和癌旁正常組織中COX17 蛋白的差異表達(dá)

20對(duì)胃癌和癌旁正常組織石蠟包埋，制作組織切片進(jìn)行IHC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織及癌旁組織COX17蛋白的表達(dá)水平不一致，有16對(duì)（16/20，80%）腫瘤組織的COX17蛋白表達(dá)水平低于癌旁正常組織（圖2），癌與癌旁組織COX17 蛋白表達(dá)差異具有顯著性（表2. p<0.001）。

3 結(jié)論

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)了胃癌組織中COX17表達(dá)下降，表明COX17表達(dá)下調(diào)與活性氧自由基形成有關(guān)[1-2]。因此，推測COX17可能從兩方面介入胃癌的發(fā)生發(fā)展。一方面，COX17的表達(dá)改變可以通過活性氧自由基增加正常細(xì)胞突變幾率并為腫瘤細(xì)胞提供選擇壓力，利于腫瘤細(xì)胞形成。另一方面，COX17基因表達(dá)下調(diào)能減少細(xì)胞色素C氧化酶的組裝，減少氧氣的消耗，更好地適應(yīng)腫瘤組織中低氧環(huán)境，更有利于腫瘤的生長。因此，COX17表達(dá)下調(diào)在胃癌的形成及發(fā)展中可能具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kim BE， Nevitt T， Thiele DJ： Mechanisms for copper acquisition， distribution and regulation.Nat Chem Biol，2008，4：176-85，

[2] Cobine PA， Pierrel F， Winge DR： Copper trafficking to the mitochondrion and assembly of copper metalloenzymes. Biochim Biophys Acta， 2006，1763：759-72.