何寧　張莉蓉

【摘 要】目的：了解阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)NF-κB的激活情況。方法：選用12月齡的阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因陽性小鼠為模型，同窩生野生型小鼠為對照，免疫熒光法檢測其海馬內(nèi)NF-κB的表達。結(jié)果：與對照鼠相比，AD轉(zhuǎn)基因模型小鼠海馬細胞內(nèi)NF-κB的表達增多。結(jié)論： NF-κB在阿爾茨海默病的發(fā)病中可能起重要作用。

【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默??；轉(zhuǎn)基因小鼠；海馬；免疫熒光

阿爾茨海默?。ˋlzheimers Disease，AD）是一種進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為記憶減退、認知障礙等，發(fā)病機制尚不完全明確[1]。

核因子κB（NF-κB）是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，與神經(jīng)細胞的生長、發(fā)育、塑型有關(guān)，在多種急、慢性神經(jīng)退行性變中發(fā)揮作用，本文擬通過研究阿爾茨海默病小鼠模型海馬中NF-κB水平的變化，了解其在阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料、儀器

1.1實驗材料

1.1.1主要試劑

兔抗鼠NF-κB多克隆抗體（Santa Cruza公司），Tap酶（Promega公司），蛋白酶K、dNTP（大連寶生物工程有限公司），Tris（上?；瘜W(xué)試劑總廠有機化工廠），PCR引物 （北京百泰克生物技術(shù)有限公司合成）。

1.2主要儀器

熒光顯微鏡（BX61， Olympus），擴增儀Gene AMP 2400，TA-2R臺式冷凍離心機（上海市離心機械研究所），DYY-Ⅲ-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠），WD-9403F紫外儀（北京市六一儀器廠）。

1.3實驗動物

動物、動物鑒定及分組：APPSWE轉(zhuǎn)基因模型鼠（Tg2576，美國Taconic Company），購于南京大學(xué)模式動物研究所，隨機選取同窩生的APPSWE陽性小鼠和陰性鼠進行實驗。

2 實驗方法

2.1 DNA提取

小鼠出生后10d，剪尾巴0.5cm，置1.5ml EP管，加緩沖液（500?l 消化液+5?l 蛋白酶K）500?l，55℃的水浴中消化過夜；消化好的組織搖勻，每管加入500?l酚/氯仿（體積比1：1），混勻、離心（12000rpm，10min）；轉(zhuǎn)移上清液400?l至新的1.5ml EP管內(nèi)，加800?l無水乙醇混勻，離心（12000rpm，5min）后棄去上清，加入800?l70%乙醇，離心（12000rpm，5min），棄去上清后晾干；加入200?lTE，放入37℃水浴1小時助溶后低溫保存。

2.2 PCR反應(yīng)

提取的DNA置PCR儀擴增。上游引物為5 CTG ACC ACT CGACCA GGTTCT GGG T 3，下游引物為5 GTG GAT AAC CCC TCC CCC AGG CTA GAC CA 3。PCR產(chǎn)物為466bp，反應(yīng)條件：94℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸1min，共25個循環(huán)。

2.3瓊脂糖電泳 1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果。

3 免疫熒光染色

取固定好的小腦組織，切50?m冠狀片，放入24孔板內(nèi)，PB液沖洗3次，滴加兔抗鼠NF-κBp50多克隆一抗孵育過夜；取出24孔板放置30分鐘，回收一抗，PB液沖洗3次，滴加Alexa568二抗，避光室溫孵育3小時，回收二抗，PB液沖洗四次；將切片撈到玻片上，65%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察NF-κB表達。

4 實驗結(jié)果

通過NF-κB的激活圖片可知，轉(zhuǎn)基因模型小鼠的海馬內(nèi)NF-κB的表達多于對照小鼠。

5 討論

NF-κB是一個多功能核轉(zhuǎn)錄因子，最先在B淋巴細胞中發(fā)現(xiàn)，其能與免疫球蛋白k輕鏈基因κB特異結(jié)合，故稱之為核因子-κB。NF-κB激活后參與許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在感染、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細胞增生、細胞凋亡等過程中發(fā)揮作用。

實驗結(jié)果提示阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)的表達增高，提示NF-κB的異常表達在阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。應(yīng)該注意到，NF-κB的激活可能誘導(dǎo)抗凋亡基因，也可能誘導(dǎo)促凋亡基因，結(jié)果依賴于刺激信號的類型和細胞差異[2]。已知的研究[3-6]表明可能存在以下兩種途徑的細胞凋亡：（1）NF-κB誘導(dǎo)抗凋亡因子；（2）通過蛋白間相互作用而干預(yù)凋亡信號通路。

本實驗無法了解NF-κB是促進凋亡還是抑制凋亡，因此仍需進一步實驗分析不同日齡的阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩野生型小鼠腦組織NF-κB激活情況，結(jié)合不同日齡轉(zhuǎn)基因小鼠與同窩生野生型小鼠腦組織細胞凋亡情況，才可以了解NF-κB是促進凋亡還是抑制凋亡，為阿爾茨海默病的發(fā)病機制和臨床治療提供更充分的理論依據(jù)。

參考文獻：

[1] 王德生， 張守信主編. 老年性癡呆. 人民衛(wèi)生出版社， 第一版， 2001：60-62.

[2] Grilli M， Memo M. Nuclear factor-kappa B/Rel proteins： a 74 apoptosis and downstream pathways incardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol， 2001， 33：1223-1232.

[3] Shinichi K， Masashi S， Futoshi T， et al. Evidence that denovoprotein synthesis is dispensable for anti-apoptotic effects of NF-kB. Oncogene ， 2000， 19：2233-2239.

[4] Zong WX， Edelstein L C， Chen C， et al. Theprosurvival Bcl -2 homolog Bfl-1/A1 is a direct transcrip-tional target of NF-kappa B that blocks TNFa-inducedapoptosis. Genes Dev， 2003， 13：382-387.

[5] Lee HH， Dadgostar H， Cheng Q， et al. NF-kappa B mediated up-reg?lation of Bcl-x and Bfl-1/A1 is required for CD40 survival signaling in B lymphocytes. Proc Natl Acad Sci， 2003， 96：9136-9141.

[6] Li HL， Chen DD， Li XH， et al. Changes of NF-kB， p53， Bcl-2 and caspase in apoptosis induced by JTE-522 in human gastric adenocarcinoma cell line AGS cells： role of reactive oxygen species. World J Gastro enterol， 2002， 8：431-435.