李菁

【摘 要】目的：分別檢測膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （matrix metalloproteinases-9，MMP-9）在胃癌中的表達及其相關(guān)性，探討二者與胃癌臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。 方法：采用免疫組化SP方法，研究63例胃癌組織和20例正常胃黏膜組織中Annexin A2 、MMP-9的表達。結(jié)果：AnnexinA2 和MMP-9在胃癌組織中的陽性表達率為90.5%、93.7%，高于正常胃黏膜組織中的表達率35%、25%，兩組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。annexinA2、MMP-9在胃癌組織中的陽性表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性（P<0.05），而與患者性別、年齡沒有相關(guān)性（P>0.05）。胃癌組織中Annexin A2和MMP-9的表達具有相關(guān)性，切呈正相關(guān)（r=0.263，P <0.05）。結(jié)論：Annexin A2、MMP-9在胃癌中的表達與胃癌惡性生物學行為密切相關(guān)，研究二者在胃癌組織中的表達可為胃癌的診斷和預后判斷提供新思路。

【關(guān)鍵詞】胃癌；免疫組化；膜聯(lián)蛋白A2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤，導致其預后差死亡率高的主要原因是其發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，給患者治療帶來了極大的困難，大大降低了患者的生存率。目前研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A2（Annexin A2）對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程的影響主要通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)F.actin細胞骨架及與細胞外各種蛋白水解酶相互作用等實現(xiàn)的。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）成員之一，能夠降解細胞外基質(zhì)，腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。本文對Annexin A2和MMP-9在胃癌組織中的表達進行研究，并分析二者在胃癌組織中表達是否具有相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集延安大學附屬醫(yī)院病理科2011年至2012年63胃癌術(shù)后蠟塊標本，從中選取20例癌旁正常組織（距胃癌組織大于5cm）。全部病例均經(jīng)手術(shù)和常規(guī)病理證實，術(shù)前未行任何化療、放療。其中男性49例，女性14例，年齡34歲到81歲，平均年齡60.6歲。病理類型： 高中分化腺癌30例，低分化腺癌33例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例；TNM分期Ⅰ期及Ⅱ期共30例，Ⅲ期及Ⅳ期共33例；每個病理資料完整，每個病理蠟塊取切片4-6張，分別作預實驗及免疫組化染色之用，制成連續(xù)切片，便于實驗過程中作對比。

1.2 實驗試劑 兔抗人annexinA2單克隆抗體、兔抗人MMP-9單克隆抗體均為即用型，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判斷 免疫組化采用SP法，每個病例切片分為二部分，分別檢測annexinA2 和MMP-9蛋白在胃癌組織中的表達。annexinA2 和MMP-9

陽性染色均位于細胞漿和（或）細胞膜上，呈棕黃色，顯色強時為棕褐色。在光鏡下用高倍鏡視野對每例組織切片癌組織區(qū)域連續(xù)計數(shù)500個細胞，計算癌細胞所占的陽性比例。組織中胞漿為黃色或棕黃色為陽性，將陽性細胞染色數(shù)量分3級：弱陽性，陽性細胞數(shù)< 10 % ，顯色強度淡黃色（1分）；強陽性，陽性細胞數(shù)> 65 % ，細胞呈黃色或棕黃色（3分）；中等陽性，陽性細胞數(shù)及顯色強度界于弱陽性和強陽性之間（2分）；無陽性，陽性細胞數(shù)無（0分）。陽性細胞數(shù)得分與染色強度得分相加，≥5分為陽性（+），<3 分為陰性（-）。顯色強度與背景色無差異者為陰性。結(jié)果由3個以上病理研究者進行閱片，結(jié)果不統(tǒng)一者，進行重新閱片，以多數(shù)觀察者的結(jié)果為標準。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 1 7.0軟件包進行統(tǒng)計分析，annexinA2 和MMP-9與胃癌各臨床病理相關(guān)因素之間的差異性比較采用X2檢驗，Spearman等級相關(guān)分析用于各指標間相關(guān)性研究。α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 annexinA2、MMP-9在胃癌和正常胃粘膜組織中的表達

胃癌組織中的annexinA2、MMP-9陽性表達率分別為90.5%（57/63）和93.7%（59/63），正常胃黏膜annexinA2、MMP-9陽性表達率分別為35.0%（7/20）和25.0%（5/20），經(jīng)X2檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.2 annexinA2、MMP-9表達與胃癌組織臨床病理特征關(guān)系

經(jīng)X2檢驗：annexinA2、MMP-9在胃癌組織中的表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性（P<0.05），而二者與患者性別、年齡均無相關(guān)性（P>0.05）。

2.3胃癌組織中annexinA2表達與MMP-9表達的相關(guān)性

胃癌組織中57例annexinA2表達陽性者，其MMP-9表達陽性53例，表達陰性4例；6例annexinA2表達陰性者，其MMP-9表達陽性4例，表達陰性2例。經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析，annexinA2和MMP-9在胃癌組織表達具有相關(guān)性，切呈正相關(guān)性（r=0.263 ，P<0.05）。

3 討論

惡性腫瘤的主要生物學特性是浸潤和轉(zhuǎn)移這也是惡性腫瘤患者的主要死因。人們對腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的機制進行了廣泛的研究，并發(fā)現(xiàn)細胞外基質(zhì)在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。細胞外基質(zhì)是由細胞分泌到細胞外間充質(zhì)中的蛋白質(zhì)和多糖類大分子物質(zhì)，構(gòu)成復雜的網(wǎng)架，連接組織結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)組織的發(fā)育和細胞生理活動，是阻礙腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的天然屏障，腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移初期，腫瘤細胞能夠分解細胞外基質(zhì)從中通過。細胞外基質(zhì)包括膠原蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、TN-C及其他多種蛋白比如基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑等，有研究表明AnnexinA2是TN-C的受體，它們和基質(zhì)金屬蛋白酶共同作用于細胞間質(zhì)，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

膜聯(lián)蛋白（Annexin，ANX）是一個Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族，物種間膜聯(lián)蛋白高度保守，脊椎動物細胞中膜聯(lián)蛋白被定義為膜聯(lián)蛋白A家族，其家族在人類存在12個成員，主要有A1--A11和A13，而膜聯(lián)蛋白A2又稱膜聯(lián)蛋白Ⅱ、ANXⅡ、LPc2P36、LipoeortinⅠ和CalpactionⅠ重鏈[1-2]。AnnexinA2可分布于細胞的胞核、胞漿及細胞的表面，胞外的AnnexinA2是組織型纖溶酶原激活物、纖溶酶原及細胞黏合素C的受體，這些蛋白酶及其底物均與腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。研究證實在腫瘤細胞表面已有組織蛋白酶B與AnnexinA2四聚體相互作用，由此推測：通過AnnexinA2使以上多種蛋白酶及其底物在腫瘤細胞表面共區(qū)域化，可能促進：激活蛋白酶前體啟動蛋白水解級聯(lián)反應；選擇性降解細胞外基質(zhì)蛋白，從而導致腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤灶脫離并遷移、侵犯局部組織。AnnexinA2是纖溶酶原和組織性纖維蛋白酶原激活劑（tPA）的受體，可以促進纖溶酶的產(chǎn)生并激活其蛋白水解功能，產(chǎn)生纖溶酶，而已知過量的纖溶酶能降解血管壁細胞外基質(zhì)和基底膜。在腫瘤血管生成和浸潤轉(zhuǎn)移中也有重要作用。因此，AnnexinA2作為蛋白酶和細胞外基質(zhì)蛋白的受體能夠激活蛋白酶并啟動蛋白水解級聯(lián)反應，選擇降解細胞外基質(zhì)蛋白和基底膜，從而導致腫瘤細胞的粘附、浸潤和轉(zhuǎn)移[3-4]。

MM -9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）成員之一，也是MMPs中分子量最大的酶，與MMPs的其他成員一樣，其也是具有鋅脂結(jié)構(gòu)的鈣依賴性蛋白水解酶，能夠降解細胞外基質(zhì)（ECM）中的Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原和明膠，在上皮或內(nèi)皮細胞的基底膜部，ECM以基底膜的形式存在，因此，MM-9能夠通過破壞基底膜的完整性，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，MM -9具有調(diào)節(jié)細胞粘附力的功能，幫助癌細胞完成對ECM的粘附、脫離和遷移[5]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展有賴于腫瘤新生血管的生成，MM -9通過降解基底膜和細胞外基質(zhì)有促進血管內(nèi)皮遷移和血管塑形，促進腫瘤新生血管的生成[6]。也有人認為MM -9參與腫瘤血管的生成可能是通過血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）改變內(nèi)皮細胞的活化形式，增強MMP-9的釋放，加快基底膜的降解和內(nèi)皮細胞的遷移來促進腫瘤血管的生成[7]。近年來，國內(nèi)外學者在許多腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)MMP-9高表達，并發(fā)現(xiàn)其表達程度與腫瘤的侵襲性有關(guān)[8-11]。

本實驗采用免疫組化SP方法檢測63例胃癌組織和20例正常胃黏膜組織中AnnexinA2 和MMP-9的表達。結(jié)果顯示，AnnexinA2 和MMP-9在胃癌組織中的陽性表達率為90.5%、93.7%，高于正常胃黏膜組織中的表達率35%、25%，兩組之間比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。annexinA2在胃癌組織中的陽性表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期具有相關(guān)性（P<0.05），王勇[12]等研究發(fā)現(xiàn)，AnnexinA2不但在胃癌中呈高表達，且與胃癌分期、浸潤深度等病理學特征也有良好的相關(guān)性，越是晚期胃癌，表達越高，這與本實驗結(jié)果一直。MMP-9的表達與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移組（P<0.01），這與Kabashima[13]等研究結(jié)論相同。同時發(fā)現(xiàn)MMP-9在胃癌中的表達與其分化程度、浸潤深度及TNM分期密切相關(guān)（P<0.05），由此推測，MMP-9在胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移過程中有著重要的意義。結(jié)果顯示，二者在胃癌中的表達與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。這提示聯(lián)合檢測二者在胃癌中的表達，可能為胃癌的診斷及預后提供新的依據(jù)，但具體機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Hoshida Y，T.Toffanin S，Lachenmayer A， et al.Molecular classification and novel targets in hepatocellularn carcinoma：recent advancement[J].Semin Liver Dis，2010，30（1）：35-51.

[2] Stefaniuk P，Cianciara J，Wiercinska-Drapalo A.Present and future possbilities for early diagnosis of hepatocellular[J].Woeld J Gastroenterol，2010，16（4）：418-424.

[3] Liu Q，Duan ZP，Ha DK，et al.Synbiotic modulation of gut flora：effect on minimal hepactic encephalopathy in patirents with liver cirrhosis[J].Hepatology，2004，39（5）：1441-1449.

[4] Rayes N，Seehofer D，Neuhaus P，Prebitoics，synbiotics in surgery—are they only trendy，truly effective or even dangerous？ [J].Langenbecks Arch Surg，2009，394（3）：547-555.

[5] Yamada K，，Endogenous modulator for drug dependence [J].Biol Pharm Bull，2008，31（9）：1635-1638.

[6] Zacker S，Mirza H，Conner CE，et a1.Vascular endothelial growth factor induces tissue factor and matrix metalloproteinase production in endothelial cells：conversion of prothrombin to thrombin results in progelatinase A activation and cell proliferation[J].Int J Cancer，1998，75（5）：780.

[7] Hofmann UB，WestphaI JR，Vanmuijen GN，et al . Matrix metaIIoproteinases in human meIanoma[J]. J Invest DermatoI，2000，115（3）：337 - 344 .

[8] Hdnuum UB，Westphal JR，Van KrtmtsA A，et a1.Expression of integrin alpha（v）beta（3）correlates with activation of membarypematrix metalloproteinase-1（MTI·MMP）and matrix metallopmteinase-2（MMP-2）in human melanoma cells invitro and in vivo[J].Int J Cancer，2000，87（1）：12-19

[9] Nemeth J A，Yousif R，Herzog M，et a1.Marxmetalloproteinase activity，bone marxturnover.and tumor cell proliferation in pros tatecancer bone metastasis[J].J Natl Cancer lnst，2002，94（1）：17-25

[10] Koyama H，1 wata H，Kuwabara Y，et a1.Gelatlnolytie activity of matrixmetalIoproteinase-2 and-9 in oesophageai carcinoma in study using in situ zymogaphy[J].Eur J Cancer，2000，36（1 6）：2l64-2170.

[11] Bodey B，Bodey BJ，Siegel SE，et a1.Immunocytochemicai detection of matrix metalloproteinase expression in prostate Cancer[J].InVivo，200l，15（I）：65-70.

[12] 王勇，丁俊，杜林.AnnexinA2在胃癌組織中的表達及其臨床病理的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2004，44：19-20.

[13] Kabashima A，Machara Y，Kakeji Y，et a1.Clineopatholofical features and over expression of matrix metallopmteinases in intramucoral gastric carci-noma with Lymph node metastasis[J].Clin Cancer Res，2000，6（9）：3581—3584.