金典生　魏理　張慶琛

摘要：以辣椒（Capsicun annuum L.）子葉和下胚軸為外植體，考察卡那霉素和羧芐青霉素對辣椒愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響。結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)基中抗生素濃度的提高，辣椒外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸降低，褐化率升高。和卡那霉素相比，羧芐青霉素的影響稍弱，其濃度為500 mg/L時(shí)外植體愈傷組織誘導(dǎo)情況仍較好。此外，與下胚軸相比，子葉分化形成不定芽的頻率更高。

關(guān)鍵詞：辣椒（Capsicun annuum L.）；外植體；愈傷組織；抗生素

中圖分類號：S641.3；S339.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2013）09-2185-03

辣椒（Capsicun annuum L.），又名番椒、海椒、青椒、椒子、秦椒等，屬雙子葉植物綱茄目茄科辣椒屬植物。辣椒含有人體必需的碳水化合物、蛋白質(zhì)以及各種維生素等，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，一直深受人們的喜愛，在世界各地廣泛栽培[1]。多年來一直困擾辣椒生產(chǎn)的一個(gè)主要問題是其容易受病菌的侵染，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)大大降低。通過常規(guī)的育種手段從現(xiàn)有品種中篩選出高抗、優(yōu)質(zhì)的品種難度大、耗時(shí)長，而且會(huì)造成作物遺傳多樣性的下降和有益基因的流失[2]。生物技術(shù)的快速發(fā)展，特別是基因工程的迅速興起，使人們能定向地將一些抗病蟲害的基因?qū)朕r(nóng)作物，改良物種[3]，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在辣椒品種培育中的應(yīng)用得到了飛速發(fā)展，其中應(yīng)用最廣泛的是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，它具有轉(zhuǎn)化方法簡單、效率高和拷貝數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，因而倍受人們關(guān)注[4]。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，篩選培養(yǎng)基中往往要添加抗生素用于抑制農(nóng)桿菌和作為抗性選擇標(biāo)記。由于不同種類的抗生素對農(nóng)桿菌菌株的抑制效果不同，不同作物的外植體對抗生素的反應(yīng)也存在差異，而且有的抗生素在使用中表現(xiàn)出植物激素類似物的效應(yīng)，影響植物組織的生長和分化[5]。所以，在辣椒進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化之前，研究抗生素對辣椒愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響，確定合適的抗生素及適宜的濃度，對于更好地從事辣椒轉(zhuǎn)基因研究至關(guān)重要。本研究選用了卡那霉素（Kanamycin）和羧芐青霉素（Carbenicilin）2種抗生素，探討其對辣椒愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響，以期為提高辣椒基因轉(zhuǎn)化效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒種子購自北京中良信農(nóng)業(yè)技術(shù)開發(fā)有限公司?？敲顾睾汪绕S青霉素均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 辣椒無菌苗的獲得 選取新鮮飽滿的辣椒種子經(jīng)滅菌水浸泡10 min，70%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇消毒30 s，滅菌水漂洗3次（2～3 min/次），0.1 g/mL的次氯酸鈉浸泡15 min，滅菌水漂洗5～6次（2～3 min/次），轉(zhuǎn)入無菌的培養(yǎng)皿濾紙上將水分吸干[6]。取經(jīng)無菌處理過的辣椒種子，在超凈工作臺(tái)上將其轉(zhuǎn)入經(jīng)高溫滅菌過的種子培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基約10粒種子，然后于25 ℃、光照條件下培養(yǎng)14 d左右至兩片子葉完全展開而未長出真葉[7]。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng) 取無菌培養(yǎng)的辣椒幼苗，在超凈工作臺(tái)上將其子葉切成0.5 cm×0.5 cm的片狀，下胚軸剪切成長0.5 cm左右的小段，分別接種于篩選培養(yǎng)基上，在25 ℃、光照條件下培養(yǎng)，3周后觀察其愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率。

1.2.3 培養(yǎng)基 ①種子培養(yǎng)基。MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8～6.0）。②誘導(dǎo)培養(yǎng)基。MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8～6.0）。③篩選培養(yǎng)基。MS+5.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8～6.0），附加不同濃度的卡那霉素（0、10、20、30、50 mg/L）或羧芐青霉素（0、200、300、400、500 mg/L）。④伸長培養(yǎng)基。MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L GA3+3%蔗糖+0.7%瓊脂（pH 5.8～6.0）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗生素及濃度對辣椒愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以辣椒無菌苗的子葉和下胚軸為外植體，接種于含不同濃度抗生素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，3周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和外植體褐化率，結(jié)果見表1。由表1可知，在沒有添加任何抗生素的對照培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到92.00%以上。愈傷組織誘導(dǎo)率隨著培養(yǎng)基中抗生素羧芐青霉素和卡那霉素濃度的升高而下降，并且出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。羧芐青霉素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響較小，其在培養(yǎng)基中的濃度升高到500 mg/L時(shí)辣椒外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率仍較高，達(dá)到84.00%，且褐化率較低，僅為4.00%。而卡那霉素對愈傷組織的誘導(dǎo)有較強(qiáng)的抑制作用，誘導(dǎo)率隨其濃度的升高迅速下降，卡那霉素濃度僅為10 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率即下降至75.00%，褐化率則隨其濃度的升高不斷升高，卡那霉素濃度為50 mg/L時(shí)褐化率高達(dá)28.57%。

2.2 外植體類型對愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響

本實(shí)驗(yàn)取兩周左右苗齡的辣椒子葉和下胚軸作為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)同等培養(yǎng)條件下，下胚軸經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)長出不定芽，而子葉可直接誘導(dǎo)出不定芽（圖1）。

3 討論

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，要加入一定量的抗生素來抑制農(nóng)桿菌的生長和作為抗性選擇標(biāo)記，但是抗生素對農(nóng)桿菌抑制的同時(shí)對植物組織的生長也有一定的影響，為減輕或消除這種影響，進(jìn)行抗生素種類和濃度篩選的研究是必要的[8]。本實(shí)驗(yàn)用辣椒無菌苗的子葉和下胚軸作為外植體，研究不同濃度羧芐青霉素和卡那霉素對辣椒愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響。結(jié)果表明，卡那霉素對辣椒外植體愈傷組織的生長產(chǎn)生抑制作用，并且抑制作用隨著卡那霉素濃度的升高而增強(qiáng)。相對而言羧芐青霉素對辣椒愈傷組織誘導(dǎo)的影響較小，且較低濃度的羧芐青霉素對辣椒愈傷組織的生長具有一定的促進(jìn)作用，與張明洲等[9]的報(bào)道相似。

辣椒愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)是辣椒離體組織培養(yǎng)體系中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，選擇合適的外植體對獲得優(yōu)良的胚性愈傷組織及建立高效的離體再生體系至關(guān)重要。目前已有從辣椒子葉[10]、葉柄[11]、莖尖[12]、下胚軸[10]等各種外植體誘導(dǎo)出愈傷組織并形成再生植株的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用辣椒無菌苗子葉和下胚軸作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，結(jié)果表明在同等條件下下胚軸的出愈率較快，但子葉長出不定芽的頻率要比下胚軸高得多，這和朱昌叁等[13]、陳靜嫻等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，所以首選子葉作為辣椒組織培養(yǎng)的外植體。

本實(shí)驗(yàn)在辣椒不定芽長到一定程度后將其轉(zhuǎn)接到伸長培養(yǎng)基上，進(jìn)行不定芽的伸長培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)和愈傷組織誘導(dǎo)階段相比，不定芽的長度伸長了，但是生長狀態(tài)并不理想，短期內(nèi)不能達(dá)到生根移栽的程度。有研究表明，基因型、苗齡、外植體、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等都會(huì)對辣椒再生體系的建立產(chǎn)生一定的影響[10]，如何進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，促進(jìn)辣椒不定芽的生長成苗還有待進(jìn)一步研究。在進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，很容易受到污染、褐化等影響導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，因此，實(shí)驗(yàn)要嚴(yán)格在無菌條件下進(jìn)行操作，控制溫度和培養(yǎng)基成分，并及時(shí)繼代培養(yǎng)，從而盡可能地降低褐化率。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄧明華，鄒學(xué)校，周群初，等.辣椒子葉離體培養(yǎng)植株再生研究[J].長江蔬菜，2003（6）：36-39.

[2] 嚴(yán)小龍，張福鎮(zhèn).植物營養(yǎng)遺傳學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[3] 王關(guān)林，方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù)[M]. 北京：科學(xué)出版社，1998.

[4] 王 萍，吳 穎，季 靜，等.抗生素對大豆愈傷組織的誘導(dǎo)和生長的影響[J].遺傳，2001，23（4）：321-324.

[5] WANG S Q，CHEN J， LIN Z P. Studies on transformation of hrap gene into tomato[J]. Acta Horticulturae Sinica，2007，34（2）：377-380.

[6] 吳志剛，宋 明，王志敏，等.番茄組織培養(yǎng)中無菌苗培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006，22（4）：335-337.

[7] 陳火英，莊天明，張曉寧，等.HVA1基因轉(zhuǎn)化番茄及轉(zhuǎn)基因番茄耐鹽性的初步鑒定[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2006， 24（1）：1-5，12.

[8] 周春麗，郭衛(wèi)東，路 梅，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)佛手遺傳轉(zhuǎn)化主要影響因素的研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2006，14（5）：374-381.

[9] 張明洲，崔海瑞，舒慶堯，等.抗生素對高粱愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2004，30（2）：221-225.

[10] 龍 鳳，張金文. 辣椒子葉和下胚軸的離體培養(yǎng)及高效再生體系的建立[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（1）：31-37.

[11] 吳麗君，胡開林，吳智明.辣椒離體培養(yǎng)再生植株的研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（1）：73-76.

[12] 唐 亮，陳 沁，董兆龍，等.辣椒莖尖離體培養(yǎng)及植株再生[J]. 上海大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，10（5）：5-6.

[13] 朱昌叁，敬國興，袁紅旭，等. 辣椒常規(guī)品種子葉誘導(dǎo)植株再生體系的建立[J].湛江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（3）：74-77.

[14] 陳靜嫻，陳 凡. 辣椒子葉培養(yǎng)及其植株再生的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，1990（3）：255-257.