李寧　姚明華等

摘要：以攜帶抗葉霉病基因Cf-16的番茄（Lycopersicon esculentum）材料Ontario 7816為母本，感病材料07880為父本配置雜交，以親本及其F2代分離群體為研究材料，采用SSR和AFLP技術(shù)篩選與抗葉霉病基因Cf-16連鎖的分子標(biāo)記。結(jié)果表明，鑒定到與Cf-16基因連鎖的SSR標(biāo)記1個(gè)、AFLP標(biāo)記5個(gè)，并將AFLP標(biāo)記E-ACA/M-TCG219轉(zhuǎn)化為AFLP-SCAR標(biāo)記并應(yīng)用于種質(zhì)資源篩選，篩選出3份攜帶Cf-16基因的番茄材料，為抗葉霉病育種提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄（Lycopersicon esculentum）；葉霉?。籆f-16基因；SSR標(biāo)記；AFLP-SCAR標(biāo)記

中圖分類號(hào)：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）09-2066-04

葉霉病是由褐孢霉屬（Fulvia）褐孢霉[Fulvia fulva （Cooke） Cif.]引起的番茄（Lycopersicon esculentum）主要病害之一，既影響番茄產(chǎn)量又影響果實(shí)品質(zhì)，從而造成經(jīng)濟(jì)損失[1]。選育和推廣抗病品種是解決番茄葉霉病最為經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)保的途徑之一。但是防治番茄葉霉病是十分困難的，主要是由于番茄葉霉病病原菌的生理小種分化十分迅速，育成含有新的Cf抗病基因的栽培品種不久后，就會(huì)分化出侵染該基因的新致病生理小種。目前，國內(nèi)番茄抗葉霉病育種中普遍應(yīng)用的Cf-4抗病基因已被侵染，侵染Cf-9抗病基因的生理小種在華北地區(qū)也被檢測(cè)出來[2]。已報(bào)道至少有24個(gè)抗葉霉病基因被發(fā)現(xiàn)，它們能夠克服不同的葉霉病生理小種[3]，因而利用新的、具有較高抗性的Cf抗病基因?qū)⑹俏覈~霉病抗病育種的重要目標(biāo)之一。番茄與葉霉病病原菌的互作遵循“gene-for-gene”學(xué)說[4]，開展番茄抗葉霉病育種工作要根據(jù)當(dāng)?shù)厝~霉病病原菌生理小種的分化情況，利用抗病基因?qū)Σ煌硇》N的抗病性進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)的人工接種抗病性鑒定不僅需要較長(zhǎng)的時(shí)間和花費(fèi)較多的人力物力，直接影響多抗性新材料及新品種的選育進(jìn)程，而且還易受環(huán)境條件、接種技術(shù)等影響，從而導(dǎo)致鑒定結(jié)果不穩(wěn)定?？共∮N是一個(gè)長(zhǎng)期策略，合理利用抗病種質(zhì)資源保持持久抗性十分重要。分子標(biāo)記技術(shù)為快速篩選鑒定抗病基因提供了有力手段，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)番茄葉霉病抗病基因的研究方面已取得較大進(jìn)展，Cf-4和Cf-9基因緊密連鎖位于1號(hào)染色體短臂的Milky Way位點(diǎn)；Cf-2和Cf-5基因緊密連鎖位于6號(hào)染色體短臂，Cf-6基因同樣位于6號(hào)染色體短臂；Cf-11、Cf-12和Cf-19基因也分別被定位于染色體上[5-10]。

本研究應(yīng)用SSR和AFLP標(biāo)記方法對(duì)Cf-16基因進(jìn)行分子標(biāo)記研究，并將獲得的與Cf-16基因連鎖的AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，從而為開展Cf-16基因的相關(guān)分子標(biāo)記輔助育種和基因克隆奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄抗葉霉病材料Ontario 7816（含Cf-16基因，不含其他抗葉霉病基因）由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供；番茄感病親本材料07880（不含任何抗葉霉病基因），親本雜交（Ontario 7816為母本，07880為父本）的F1代，F(xiàn)1代自交獲得的F2代分離群體，番茄感葉霉病通用對(duì)照品種Money Maker（含Cf-0基因），番茄葉霉病優(yōu)勢(shì)生理小種1.2.3.4[11]以及64份番茄自交系種質(zhì)均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所收集、分離和鑒定。

1.2 方法

1.2.1 接種方法及病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 接種采用噴霧接種法[10]。接種苗齡為4片真葉期，濃度為107個(gè)孢子/mL。接種后3 d內(nèi)保持相對(duì)濕度100%，溫度22～25 ℃，使葉霉菌進(jìn)行繁殖，3 d后相對(duì)濕度降至80%保持11 d，接種14 d后調(diào)查發(fā)病情況。

單株分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)——無癥狀；1級(jí)——接種葉有直徑1 mm的白斑或壞死斑；3級(jí)——接種葉有直徑2～3 mm的黃化斑，葉背面有少量白色霉?fàn)钗铮?級(jí)——接種葉有直徑5～8 mm的黃化斑，葉背面有許多白色霉?fàn)钗铮?級(jí)——接種葉有直徑5～8 mm的黃化斑，葉背面有黑色霉?fàn)钗?，同時(shí)上部葉片也有黑色霉?fàn)钗铮?級(jí)——接種葉病斑上有大量孢子，上部葉片也有孢子形成。

1.2.2 葉片基因組DNA的提取及抗、感池的建立 葉片基因組DNA的提取采用CTAB法[12]，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度，調(diào)整各樣品DNA濃度為50 ng/μL。從F2代分離群體中隨機(jī)選取10株抗病植株和感病植株，參照Michelmore等[13]的混合分組分析法，建立抗病池和感病池，各取等量的DNA混合，對(duì)在雙親間表現(xiàn)多態(tài)性的引物進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。

1.2.5 AFLP-SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化 用滅菌的手術(shù)刀片切割目標(biāo)差異條帶，溶解于30 μL ddH2O中，37 ℃過夜，12 000 r/min離心10 s，以上清液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系同選擇性擴(kuò)增體系。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)片段進(jìn)行回收，克隆于pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化后測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果及EcoRⅠ和MseⅠ核心引物序列設(shè)計(jì)SCAR引物，并對(duì)兩親本、混合基因池及F2代單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工接種抗性鑒定及遺傳分析

2.2 SSR分析

2.3 AFLP分析

2.4 AFLP-SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化

2.5 種質(zhì)資源鑒定

對(duì)64份番茄自交系種質(zhì)進(jìn)行人工接種鑒定，共篩選出16份抗葉霉病材料，應(yīng)用獲得的AFLP-SCAR引物進(jìn)行分子鑒定（表1），共鑒定出3份含有Cf-16基因的抗葉霉病番茄材料分子標(biāo)記檢測(cè)和人工接種鑒定的結(jié)果完全吻合，說明獲得的分子標(biāo)記是可靠的，不僅在分子水平上驗(yàn)證了分子標(biāo)記的實(shí)用性與準(zhǔn)確性，而且完全可以在番茄抗葉霉病育種中應(yīng)用。

3 小結(jié)與討論

20世紀(jì)30年代以來，加拿大和美國就開始番茄葉霉病抗病育種研究，并從栽培番茄及野生番茄中篩選出多個(gè)抗源應(yīng)用于番茄抗病育種。目前，國內(nèi)育成的抗葉霉病番茄品種應(yīng)用的是Cf-4和Cf-9基因。從國內(nèi)各地區(qū)關(guān)于番茄葉霉病病原菌生理小種分化的監(jiān)測(cè)結(jié)果來看，能夠侵染Cf-4基因的生理小種1.2.3.4是我國大部分地區(qū)的優(yōu)勢(shì)生理小種，Cf-4基因已經(jīng)喪失抗性，并發(fā)現(xiàn)侵染Cf-9基因的生理小種1.2.3.4.9[2]。利用具有較高抗性的基因是我國葉霉病抗病育種的重要目標(biāo)。抗病育種是一個(gè)長(zhǎng)期工作，因而提前對(duì)較高抗性、且尚未應(yīng)用的葉霉病抗病基因Cf-16進(jìn)行研究，建立分子標(biāo)記輔助選擇體系，在時(shí)間上獲得主動(dòng)權(quán)，為應(yīng)對(duì)新分化的致病性更強(qiáng)的番茄葉霉病生理小種做好準(zhǔn)備是十分重要的工作。

分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用使我們能夠快速地進(jìn)行染色體定位和分子標(biāo)記輔助選擇。應(yīng)用SSR標(biāo)記方法，根據(jù)與Cf-16基因連鎖的SSR標(biāo)記Tom144-145，將Cf-16基因定位于11號(hào)染色體，與Kanwar等[17]通過經(jīng)典遺傳定位的結(jié)果相同。AFLP標(biāo)記技術(shù)同樣廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助選擇等。本研究中共獲得5個(gè)與Cf-16基因連鎖的標(biāo)記，其中標(biāo)記E-ACA/M-TCG219與目標(biāo)基因的遺傳距離為4.7 cM，小于5.0 cM，能夠應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇。但是，AFLP標(biāo)記方法的操作比較復(fù)雜，并且需要經(jīng)過酶切、連接等步驟，操作昂貴，不適于大規(guī)模及大群體的選擇使用，因此，本研究試圖將AFLP標(biāo)記轉(zhuǎn)化為以PCR為基礎(chǔ)的SCAR標(biāo)記。根據(jù)測(cè)序后獲得的序列信息，將E-ACA/M-TCG219標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，經(jīng)F2分離群體人工接種鑒定驗(yàn)證，吻合率為90%以上，表明篩選出的AFLP-SCAR標(biāo)記能夠應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。

參考文獻(xiàn)：

[1] HIGGINS V J， HOLLANDS J. Prevalent races of Cladosporium fulvum in southern Ontario and their benomyl sensitivity[J]. Canadian Journal of Plant Pathology，1987，9（1）：32-35.

[2] 柴 敏，于拴倉，丁云花，等.北京地區(qū)番茄葉霉病菌致病性分化新動(dòng)態(tài)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20（2）：97-100.

[3] KERR E A， BAILEY D L. Resistance to Cladosporium fulvum Cke obtained from wild species of tomato[J]. Canadian Journal Botany，1964，42（11）：1541-1554.

[4] JOOSTEN M， DE W P. The Tomato-Cladosporium fulvum interaction： A versatile experimental system to study plant-pathogen interactions[J]. Annual Review of Phytopathology，1999，37（1）：335-367.

[5] DICKINSON M J， JONES D A， JONES J D. Close linkage between the Cf-2/Cf-5 and Mi resistance loci in tomato[J]. Molecular Plant Microbe Interact，1993，6（3）：341-347.

[6] GRUSHETSKAYA Z E，LEMESH V A， POLIKSENOVA V D，et al. Mapping of the Cf-6 tomato leaf mould resistance locus using SSR markers[J]. Russian Journal of Genetics，2007（82）：7-11.

[7] HAANSTRA J P W， LAUG？魪 R， MEIJER-DEKENS F，et al. The Cf-ECP2 gene is linked to， but not part of， the Cf-4/Cf-9 cluster on the short arm of chromosome 1 in tomato[J]. Molecular and General Genetics，1999，262（4）：839-845.

[8] 趙婷婷，宋寧寧，姜景彬，等.番茄抗葉霉病基因Cf12的分子標(biāo)記篩選及種質(zhì)資源鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2012，39（5）：985-991.

[9] 許向陽.番茄葉霉病抗病基因Cf-11、Cf-19的分子標(biāo)記研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[10] WANG A， MENG F， XU X， et al. Development of molecular markers linked to Cladosporium fulvum resistant gene Cf-6 in tomato by RAPD and SSR methods[J]. HortScience，2007， 42（1）：11-15.

[11] 李春霞，許向陽，康立功.2006-2007年東北三省番茄葉霉病菌生理小種變異的監(jiān)測(cè)[J]. 中國蔬菜，2009（2）：42-45.

[12] MURRAY M G， THOMPSON F W. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J]. Nucleic Acids Research，1980， 8（19）：4321-4326.

[13] MICHELMORE R W， PARAN I， KESSELI R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis： A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1991，88（21）：9828-9832.

[14] VOS P，HOGERS R，BLEEKER M，et al. AFLP： A new technique for DNA fingerprinting[J]. Nucleic Acids Research，1995，23（21）：4407-4414.

[15] LINCOLN S， DALY M， LANDER E. Constructing Genetic Maps with Mapmaker/Exp 3.0[M]. 3rd ed. Massachusetts： Whitehead Institute Technical Report，1992.

[16] SULIMAN-POLLATSCHEK S， KASHKUSH K， SHATS H， et al. Generation and mapping of AFLP， SSRs and SNPs in Lycopersicon esculentum[J]. Cellular & Molecular Biology Letters，2002，7（2A）：583-598.

[17] KANWAR J S， KERR E A， HAMEY P M. Linkage of Cf-12 to Cf-24 genes for resistance to tomato leaf mold， Cladosporium fulvum Cke[J]. Tomato Genetics Cooperative Report，1980（30）：22-23.