劉海霞　臧鑫　王幫太等

摘 要：利用小麥成熟胚脫分化基因芯片對脫分化過程中MADS-box家族基因的表達變化進行研究，檢測到MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因共19個，上調(diào)表達基因3個，下調(diào)表達基因12個，混合表達基因4個，其中，CA730918、CK213813、BE417035、BJ276784、CA726603可能在小麥脫分化過程中意義重大。利用半定量RT-PCR技術(shù)對CA670406、CK213813、CA679889、AB107992和BJ228622基因的表達變化進行驗證，結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果相似。

關(guān)鍵詞：MADS-box家族；轉(zhuǎn)錄因子基因；脫分化；基因芯片

MADS-box名稱來源于4種MADS-box基因的首字母[1]，這4種基因分別為酵母的MCM1[2]，擬南芥的AG[3]，金魚草中的DEFICIENS[4]和人類的SRF[5]。MADS盒與識別特異的DNA序列有關(guān)，編碼該區(qū)域的基因被統(tǒng)稱為MADS-box基因[6，7]。MADS-box基因是一類序列特異的調(diào)節(jié)基因家族，它編碼的MADS-box蛋白為轉(zhuǎn)錄因子，主要功能是激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。近年來，人們對小麥MADS-box基因功能的研究逐漸增多。研究發(fā)現(xiàn)，TaVRT-1具有調(diào)節(jié)小麥營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的功能，該基因Vrn-1區(qū)域與春化處理和耐冬性有關(guān)，在春化誘導(dǎo)的植物中表達[8]。WAG是小麥中分離出的一個與AG同源異型的基因，該基因在幼穗中表達水平低，隨著穗的發(fā)育逐步增加，在孕穗期到抽穗期表達水平最高[9]。隨著研究的深入，部分基因已被克隆出來。人們從小麥中分離出兩個與心皮化有關(guān)的基因WPI1和WPI2，這兩個基因在小花的漿片原基和雄蕊原基中表達[10]。Yan等克隆了兩個與開花結(jié)實相關(guān)的基因VRN1和VRN2[11，12]，其功能分別類似于擬南芥分生組織基因AP1和AGL2。盡管對小麥MADS-box基因的研究逐漸增多，但其在成熟胚脫分化過程中的研究尚未見報道。

本試驗對小麥成熟胚進行脫分化處理，利用基因芯片技術(shù)檢測了脫分化期間部分MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因及其調(diào)控基因的表達狀況，并對基因芯片的可靠性進行驗證，為探索MADS-box基因在小麥成熟胚脫分化過程中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料處理

在超凈工作臺上，剝?nèi)∑胀ㄐ←溒贩N豫麥18成熟胚，置于MS+2，4-D（2 mg/L）培養(yǎng)基上培養(yǎng)[13]，根據(jù)小麥成熟胚脫分化過程中外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，分別于脫分化0、2、6、12、24、72 h時取樣，液氮處理后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與純化

按Invitrogen公司的Trizol試劑盒使用說明提取總RNA，并用QIAGEN公司的RNeasy mini試劑盒純化，1%瓊脂糖凝膠電泳（180 V，0.5 h）檢測總RNA的28S和18S比例（亮度約為2∶1時提取效果最好），260/280 nm波長下測定總RNA的吸光值，計算其濃度和純度。

1.3 基因芯片檢測

1.3.1 cDNA和cRNA的合成及純化 合成cDNA時，總RNA模板量為1～8 μg；合成生物素標記的cRNA時，取12 μl上述cDNA溶液為模板。cDNA、cRNA的純化按基因芯片分析樣品純化操作程序進行[14]。兩者的濃度、純度和質(zhì)量檢測方法同上。

1.3.2 cRNA片段化和雜交 取15 μl濃度為1 μg/μl的cRNA，加6 μl 5×片段化Buffer和9 μl RNase-free水混勻，94℃溫浴35 min，得到長度為35～200 bp的cRNA片段。按Affymetrix公司提供的配方配制雜交液，將雜交液加至經(jīng)預(yù)雜交處理的Affymetrix Wheat Gene Chip中，45℃、60 r/min雜交16 h，吸去雜交液，用Gene Chip全自動洗滌工作站450（Affymetrix 公司，USA）對芯片進行洗滌和染色芯片。

1.3.3 芯片檢測參數(shù)的獲取 高分辨芯片掃描儀3000（Affymetrix公司，USA）掃描芯片，獲得基因表達信號值[15]。用GCOS1.2軟件讀取、處理信號值數(shù)據(jù)，獲得歸一化后的信號值、信號檢出（P， A， M）以及試驗組和對照組的比值。

1.3.4 MADS-box家族基因的確認 利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、DATF（http：//datf.cbi.pku.edu.cn/）和DRTF（http：//drtf.cbi.pku.edu.cn/）等網(wǎng)站擬南芥和水稻等植物數(shù)據(jù)庫查找MADS-box家族基因名稱，然后在小麥基因芯片上查找對應(yīng)的名稱，并獲取各點的熒光信號值。以不同時間點的表達信號值除以0 h表達信號值（對照）并取以 2 為底的對數(shù)，對數(shù)值≤-1或≥1 為有意義下調(diào)或上調(diào)差異表達。根據(jù)基因的序列同源性，利用 NCBI 網(wǎng)站在線 BLAST 分析工具對本試驗所獲得的基因進行分類。

1.4 半定量 RT-PCR驗證

為了驗證基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性，將1.2中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參對CA670406等5個基因進行半定量 RT-PCR驗證。PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55～57℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。引物設(shè)計及產(chǎn)物長度如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 MADS-box轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因的表達變化

2.1.1 PI轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因 在小麥成熟胚脫分化過程中，檢測到編碼花器官相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子PI （PISTILLATA protein）的基因及其2個編碼小麥心皮蛋白（PISTILLATA-like protein）的靶基因WPI1 （AB107991）和WPI2 （AB107992）。如圖1，PI轉(zhuǎn)錄因子基因在2、12～24 h有意義下調(diào)表達；AB107992在2 h時下調(diào)幅度最大，為對照的6.49倍。推測在小麥成熟胚脫分化過程中PI轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因起抑制作用。

2.1.2 AGL9轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因 在小麥成熟胚脫分化過程中（圖1），發(fā)現(xiàn)編碼調(diào)節(jié)外界信號反應(yīng)蛋白（MADS-box protein） AGL9的3個基因，1個（BJ276784）上調(diào)表達，1個（CA726603）下調(diào)表達，1個（CD374109）先上調(diào)后下調(diào)，其中，CA726603下調(diào)幅度最大值為對照的21.11倍。靶基因AG（CA658343）的表達趨勢與CD374109相反，在12 h下調(diào)為對照的4.59倍，在72 h轉(zhuǎn)成上調(diào)，調(diào)節(jié)倍數(shù)為對照的4.20倍。靶基因FBP2編碼果糖-1，6-二磷酸酶（Fructose-1，6-bisphosphatase），有CA686703和CD894372兩個成員，其中，CA686703在2～12 h下調(diào)，在24～72 h轉(zhuǎn)成上調(diào)。由此推測，轉(zhuǎn)錄因子基因CD374109對其靶基因CA658343和CA686703可能有抑制作用。

2.1.3 CO轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因 在小麥成熟胚脫分化過程中，發(fā)現(xiàn)編碼開花時空相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CO（Putative zinc-finger protein）的4個基因（圖1），3個（CA730918、CA670406、BG906984）在2～72 h下調(diào)，其中，CA730918在各個時期下調(diào)幅度最大，最大值是對照的84.45倍，推測CA730918在脫分化過程中抑制作用最強。靶基因LFY（CD911368）在6～12 h有意義下調(diào)。推測，在小麥脫分化過程中CA730918對其靶基因CD911368可能具有一定的促進作用。

2.1.4 AG轉(zhuǎn)錄因子基因及其靶基因 在小麥成熟胚脫分化過程中（圖1），1個編碼調(diào)控雄蕊和心皮、花分生組織發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子AG（Floral homeotic protein）的基因CA658343在2～24 h下調(diào)，在72 h上調(diào)。靶基因SPT具有獨立促進心皮分化的功能，其中2個（CK213813、BE417035）在2～72 h上調(diào)表達趨勢呈拋物線狀，在12 h達到最大值，為對照的16倍；2個（BJ272559、CA608865）下調(diào)表達，下調(diào)幅度小。

2.2 半定量RT-PCR檢測

為了對基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性進行驗證，按照芯片數(shù)據(jù)信號值高低從MADS-box家族基因中選取CA670406、CK213813、CA679889、AB107992和BJ228622 5個基因進行半定量RT-PCR檢測，結(jié)果見圖2。將檢測結(jié)果與基因芯片結(jié)果比較可知，Affymetrix小麥基因芯片數(shù)據(jù)相對可靠。

3 討論

已有的研究結(jié)果顯示，MADS-box家族基因生物學(xué)功能非常豐富，按調(diào)節(jié)部位不同可分為花分生組織分化基因、花器官基因、成花計時基因、外界信號傳導(dǎo)基因以及根、葉調(diào)控等基因，這些基因僅在植物發(fā)育過程中的分化部位進行調(diào)控。本文利用Affymetrix小麥基因芯片首次研究了小麥成熟胚脫分化過程中19個MADS-box家族基因的表達變化，其中，3個基因上調(diào)表達，12個基因下調(diào)表達，4個基因混合表達，一方面表明MADS-box家族基因的生物學(xué)功能具有雙重性，可在與分化過程相反的脫分化過程中進行調(diào)控；另一方面表明脫分化過程是一個眾多基因參與的復(fù)雜的調(diào)控過程。本研究發(fā)現(xiàn)，CA730918、CK213813、BE417035、BJ276784、CA726603等基因在小麥成熟胚脫分化過程中表達強度變化較大，上調(diào)值最大達到對照的16倍，下調(diào)值最大達到對照的84.45倍，推測這些基因在小麥的脫分化過程中意義重大，這為進一步揭示小麥成熟胚脫分化過程的調(diào)控機理提供依據(jù)。

參 考 文 獻：

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